2022年9月29日，北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室叶新山教授团队在《自然-合成》（Nature Synthesis）上在线发表了题为“自动液相乘法合成复杂聚糖到1080糖”（Automated solution-phase multiplicative synthesis of complex glycans up to a 1,080-mer）的最新研究论文，报道了他们在液相聚糖自动合成领域的突破性研究成果。
北京大学药学院博士后姚文龙为该研究论文的第一作者，叶新山教授为论文的通讯作者。
在自然界中糖类物质无处不在，几乎参与了多细胞生物的全部生命过程。但由于糖类化合物结构固有的复杂性，想要获得结构明确均一的聚糖类化合物，合成难度大，往往需要具有高度专业技能的人员通过手工合成来完成，耗时费力，这严重制约着糖科学的发展；而对于分子尺寸更大、结构更为复杂的多糖类化合物的合成，更是一项极具挑战性的工作。聚糖的高效获取问题已成为制约糖科学发展的重要瓶颈。
多肽和DNA合成仪的研制成功，带来了多肽/蛋白质和寡核苷酸/核酸获取途径的革命，极大地推动了相关学科的发展。糖科学家也希望聚糖的合成能够像多肽和寡核苷酸那样在自动合成仪上实现。近些年来，虽然聚糖固相自动合成和酶法自动合成取得了一定的进展，但聚糖固相自动合成往往需要过量的糖模块和试剂，通常是通过单糖逐个累加的方式使糖链延伸（加法式合成），造成效率低下，而且合成规模较小、无法直接监测反应。酶法自动合成虽然能够获得一些天然的生物活性寡糖，但酶的来源有限、底物适应范围窄，无法满足各种类型的寡糖合成需要；而且酶法往往需要核苷活化的糖，价格比较昂贵；其糖链的延伸也是通过单糖逐个累加的方式而实现（即加法式合成）。因此，糖自动合成技术的发展还处于初级阶段。
近日，北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室叶新山教授团队报道了他们在液相聚糖自动合成领域的突破性研究成果。他们基于“预活化”一釜多组分寡糖合成原理，自主研发了全球首台新型双模式液相糖自动合成仪，并利用该合成仪自动合成了各种具有重要生物活性的复杂寡糖和多糖；发展了“自动乘法合成”策略，将合成的多糖尺寸提高到惊人的1080-mer，从而将聚糖合成水平提升到了一个新的高度，远超核酸（到200-mer）和蛋白质（到472-mer）的合成水平。
叶新山团队长期致力于新的糖化学合成的方法和策略的发展。2004年，他与黄雪飞教授首次明确提出“糖基供体预活化”的新概念，提出了糖基化反应的一种新方式，在此基础上发展了基于“糖基供体预活化”的一釜寡糖合成新策略（Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221）。该策略的优点是只使用带有常见保护基的糖模块，不需要对反应中间产物进行分离，省去了中间体分离纯化的步骤，从而使合成效率提高。目前该策略已经被应用于各种复杂聚糖的合成，特别是该团队在2017年运用这个策略首次合成了均一结构的由92个单糖单元所组成的阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），开创了多糖合成领域的先河（Nat. Commun., 2017, 8, 14851）。该团队还发展了光介导的“预活化”一釜糖基化反应，展示了其绿色、高效和可控性强的特点（Org. Chem. Front., 2016, 3, 737）。基于以上研究基础，该团队着手进行糖合成仪的研制工作。
图1：液相糖合成仪
合成仪的研制包括硬件和软件两个方面。硬件主要包括三部分：自动合成系统（包含自动进样系统和合成辅助系统）、在线监测系统和可编程逻辑控制系统。他们首先设计研发了新型可温控反应器，既能够满足光驱动的反应，也能满足普通的各种反应类型，适用温度范围在-80 ℃-100 ℃之间；紧接着设计研发密闭、双重控制的准确自动进样系统，进样系统在惰性气体保护下，密闭且无交叉污染的风险，配合相应的控制方案可适用于各种自动化合成；随后设计研发接近实时的在线监测系统，可以满足连续多次无交叉自动取样、进样、分析、对比判断，充分利用液相色谱的分析能力满足自动合成的直接监测需要；最后通过可编程逻辑控制系统耦合自动合成系统和在线监测系统，成功设计了新型双模式液相糖自动合成仪的整机框架，实现了第一代原型机的顺利组装（图1）。软件方面，可编程逻辑控制系统受上位机控制，基于Labview语言程序设计研发了实用的特色上位机软件控制系统（Ye Glycosoft），完成对合成仪的整机控制和调试，实现了合成仪的稳定运行。
在合成仪原型机成功研发的基础上，该团队首先用一个四糖的合成来验证仪器的可靠性，分别通过普通活化模式和光介导活化模式对四糖进行自动化合成，验证了合成仪的可行性。为了进一步验证糖合成仪的功能，该团队利用所研制的合成仪，进行了如下三个方面的工作：
图2：普通活化模式下生物活性寡糖的自动合成
（1）用合成仪合成了一个含有多种重要生物活性寡糖的化合物库。他们首先在普通活化模式下（一般以Ph2SO/Tf2O或者p-TolSCl/AgOTf作为活化体系），通过一釜五组分反应（1*5 = 5）完成了两种β-1,6连接的葡聚五糖的自动化合成；随后在此基础上通过一釜三组分反应（5*3 = 15）完成了β-1,6连接的葡聚十五糖的自动化合成。此外，通过一釜五组分反应（1*5 = 5）完成了甘露五糖的自动合成；通过一釜四组分（1*4 = 4）和一釜五组分反应（1*5 = 5）分别完成了β-1,4-连接的壳聚四糖和壳聚五糖的自动合成；通过[1+2+1+2]策略一釜自动合成了结构复杂、具有重要活性的肿瘤相关糖抗原Globo H；含有高碳糖唾液酸的肿瘤相关糖抗原Fucosyl GM1（Fuc-GM1）和cis-糖苷键的A血型糖抗原也都被成功构建（图2）。接下来，在光介导模式下，以Umemoto试剂作为光活化剂，作为N-聚糖和多种肿瘤相关糖抗原核心骨架的polyLacNAc八糖通过四组分反应（2*4 = 8）被成功构建；紧接着作者通过一釜三组分策略完成了以LNT（Lacto-N-tetraose）和LNnT（Lacto-N-neotetraose）为核心结构的七种重要生物活性抗原（H型抗原、B/O血型抗原和LewisX、LewisY抗原）的自动化合成（图3），这些抗原是人乳寡糖和鞘糖脂的重要组成部分。
图3：光介导活化模式下生物活性寡糖的自动合成
（2）以克级规模高效自动制备保护的磺达肝葵钠五糖。磺达肝葵钠是首个也是目前唯一一个人工合成的已上市肝素类寡糖抗凝药物，于2002年上市。虽然目前已有化学合成和化学酶法合成的报道，然而超过50步、总收率低于0.1%的化学合成使其成为最贵的肝素类药物，限制了其应用。该团队以p-TolSCl/AgOTf作为活化体系，通过[1+2+2]策略高收率地自动合成了保护的磺达肝葵钠五糖（图4）。这是磺达肝葵钠五糖的首次自动化制备，其合成规模易于放大的特点对于磺达肝葵钠制备工艺的改进具有重要意义。
图4：克级规模自动制备保护的磺达肝葵钠五糖
（3）多组分自动乘法合成阿拉伯聚糖。在前面工作基础上，作者开始研究一釜更多组分数的自动合成和大分子尺寸多糖的自动组装。他们选择了植物和致病菌细胞壁都普遍存在的阿拉伯聚糖作为合成目标。以p-TolSCl/AgOTf作为活化体系，能够以一釜十组分反应（1*10 = 10）实现阿拉伯十糖的自动化合成，分离收率为47%（平均每步92%），完成了手工合成难以完成的工作。
在高收率克级规模自动制备阿拉伯六糖的基础上，作者继续通过自动乘法合成策略来制备大分子尺寸的阿拉伯聚糖。反应过程包括重复的两次操作：（1）自动一釜多组分反应获得供体中间体；（2）脱除供体中间体上的临时保护基得到受体中间体。从单糖模块出发，自动一釜六组分反应得到六糖供体（1*6 = 6），脱除六糖供体上的临时保护基（TBS）得到六糖受体；自动一釜五组分反应得到三十糖供体（1*6*5 = 30），脱除三十糖供体的临时保护基得到三十糖受体；自动一釜四组分反应得到一百二十糖供体（1*6*5*4 = 120），脱除一百二十糖供体的临时保护基得到一百二十糖受体；自动一釜三组分反应得到三百六十糖供体（1*6*5*4*3 = 360），脱除三百六十糖供体的临时保护基得到一个三百六十糖受体；自动一釜三组分反应[360+360+360]，得到惊人的1080糖（分子量达到352,700 Da）。该大分子尺寸的阿拉伯聚糖通过五步乘法扩增获得（1*6*5*4*3*3 = 1080），是目前人工合成的最大、最长的均一结构的多糖分子。最后，作者通过优化条件，将保护的1080糖进行保护基脱除（1个TBS、1080个Bz和1080个Bn，共2161个保护基），得到完全脱保护的1080糖（分子量达到142,800 Da）（图5）。
图5：由单糖开始自动乘法合成线性1080-mer阿拉伯聚糖
该团队基于糖基供体“预活化”一釜寡糖合成和连续乘法合成原理，研制出一种新型双模式的液相糖自动合成仪，它克服了现有的通过单糖逐个累加方式延伸糖链方法的缺陷。该合成仪的实用性从三个方面得到了验证：（1）在普通活化模式或者光介导活化模式下，成功合成了包括各种糖型和糖苷键、具有重要生物活性的寡糖化合物库；（2）合成了保护的抗凝糖药物磺达肝葵钠五糖，可以实现克级规模的制备；（3）成功执行了“一釜”十组分自动偶联反应得到阿拉伯十糖；进而利用自动乘法合成策略，合成了结构均一的阿拉伯聚糖（1080糖！）。这使得代表着人工合成均一结构生物大分子复杂度的单体组成数目首次达到了四位数水平，在多糖合成领域具有重要的里程碑式意义。该合成仪将为非专业人员提供一个组装目标聚糖的平台，填补国内外在液相糖合成仪研制方面的空白，将为糖科学及其在医药和材料领域的应用提供新的有效的工具。（来源：科学网）
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s44160-022-00171-9
