论文标题：Comparing Two Varieties of Blood Orange: A Differential Methylation Region Within the Specific Encoding Sequence of a Retrotransposon Adjacent to the Ruby Locus

论文链接：https://doi.org/10.3390/horticulturae11080966

期刊名：Horticulturae

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/horticulturae

文章导读

血橙 (Citrus sinensis) 是唯一含有花青苷的柑橘品种。富含花青苷的水果作为一种膳食营养素在预防和干预代谢综合症方面具有一定生理功能。四川省资中县血橙种植面积超过1.15万公顷，年产量达40万吨，是全国面积最大、产量最高的血橙生产基地，已初步形成了种植、采后商品化处理与精深加工的完整产业链，年产值达77亿元，被誉为“中国血橙之乡” (图1)。成熟时血橙花青苷含量较少、着色不均匀，同时有机酸含量过高等产业问题制约了当地果农增收与乡村振兴。目前血橙果实花青苷合成的调控机制仍然不清楚，因此影响了高花青苷含量的品种选育与优质商品果生产。

图1. 四川已在资中县建立了“一廊三区”中国最大的血橙基地。

2025年8月14日，成都大学食品与生物工程学院王建辉副研究员与资中县血橙产业发展中心陈英主任研究团队在 Horticulturae 期刊发表了一篇题为“Comparing Two Varieties of Blood Orange: A Differential Methylation Region Within the Specific Encoding Sequence of a Retrotransposon Adjacent to the Ruby Locus”的研究论文。本文分别开展了两个血橙品种的品质分析、转录组测序、蛋白质双向电泳、转基因功能验证、重亚硫酸氢盐测序等实验，初步揭示了Ruby基因上游区域的差异甲基化修饰可能影响血橙花青苷合成，相关研究结果将为血橙品种选育与优质鲜果生产奠定一定理论基础。

研究内容

Ruby等基因差异表达影响血橙花青苷合成

研究团队发现具有较高花青苷含量的血橙品种的果实汁胞细胞中转录因子Ruby和TT8的mRNA水平上调。与之比较，低花青苷含量的血橙品种中上述关键基因下调表达。此外，利用蛋白质双向电泳和质谱技术对这两个不同花青苷含量的品种进行比较分析，在汁胞细胞中没有发现花青苷生物合成与调控相关的差异表达蛋白。拟南芥中过表达血橙Ruby转基因植株与野生型对照相比较，转基因植株中不同组织的花青苷含量显著提高。同时，构建Ruby上游DNA区域中插入的逆转座子的长末端重复 (LTR) 序列融合表达GUS蛋白，经过转基因幼苗的组织化学染色，表明了LTR序列具有驱动GUS基因表达的能力。

Ruby位点上游特定DNA区域发生差异甲基化修饰

分别克隆了两个不同花青苷含量的血橙品种中Ruby上游区域 (全长2164 bp的部分逆转座子序列)，结果表明来源于两个血橙品种的逆转座子的核酸序列完全相同，但是果实具有显著差异的花青苷含量。Ruby位点上游区域中插入一个逆转座子，其编码一个Gag-Pol多肽的编码序列 (−2191到−1887 bp) 具有差异甲基化修饰，高花青苷含量品种的甲基化率为67.5%，然而低花青苷品种仅为80.2 %。与之相比较，在Ruby基因包含LTR的上游区域 (−544到−194 bp) 具有高度甲基化修饰，而且高花青苷含量品种与低花青苷品种的甲基化率分别为94.9%与86.7%，但两个品种这个DNA区域的甲基化率没有显著差异 (p > 0.05)。转录物起始位点位于Ruby基因起始密码子ATG上游551 bp处的LTR序列中腺嘌呤。Ruby上游位置插入一个逆转座子的Gag-Pol多肽编码区域存在差异甲基化，并且花青苷含量较低的果实中具有更高的平均甲基化率。我们推测Ruby上游特定核酸位置的甲基化修饰可能会下调Ruby表达，从而影响血橙花青苷的积累 (图2)。

图2. 血橙果实汁胞细胞可能通过甲基化修饰调控花青苷合成。

柑橘类种质进行红肉性状进行分子标记

设计一对上、下游引物序列 (FanFan/XiXi) 特异扩增了柑橘叶片DNA中Ruby (从第1外显子起始密码子ATG上游551 bp开始启动转录) 的位点上游一段全长304 bp序列，通过扩增特定大小的DNA片段来快速鉴定柑橘类水果中具有花青苷积累的红色果肉性状 (图3A)。一种亲本“太田”椪柑嫁接在亲本“摩洛”血橙上，发生嵌合体变异并且筛选获得子代“媛红”椪柑，只在具有红肉性状的亲本“摩洛”与嵌合体子代“媛红”中扩增出一条全长304 bp的DNA片段，然而黄肉性状亲本“太田”椪柑没有这条特异大小的DNA扩增条带 (图3B)。

图3. 快速特异检测柑橘类品种中具有花青苷积累的红色果肉性状。(A) 在Ruby上游区域设计一对特异性扩增引物；(B) 利用上述引物对分别对两个亲本、1个嵌合突变体子代进行分子检测。

研究总结

本研究比较分析了不同花青苷含量的血橙品种，首次发现了关键转录因子的上游区域发生了差异甲基化修饰，可能影响果实花青苷的积累。此外，还有以下结论：

•Ruby和TT8关键转录因子在高花青苷含量血橙品种的汁胞细胞中上调表达。

•Ruby上游区域插入的逆转座子Gag-Pol多肽的编码序列发生了差异甲基化修饰。

•根据Ruby上游区域的基因组结构，设计了一对特异引物成功检测了具有花青苷积累形成的红肉性状的种质资源。

本研究从分子水平上解析了上调表达参与糖酵解、三羧酸循环途径的蛋白质可能促进低糖、高酸的血橙果实品质形成。Ruby与其它转录蛋白共同形成一个花青苷转录激活复合体，在血橙花青苷合成途径中发挥重要的调控作用。基于Ruby上游插入一个逆转座子的特殊基因结构进行PCR扩增来开展红肉性状的分子标记。相关研究成果将有助于血橙新品种选育，为精深加工产业奠定了优质的原料基础。

Horticulturae 期刊介绍

主编：Luigi De Bellis, Università del Salento, Italy

期刊重点关注温带到热带园艺的所有领域及相关学科，主题包括果树、蔬菜、花卉、苗圃和风景、以及草药和香料作物等，研究涉及整个园艺供应链。