论文标题：An upgraded nuclease prime editor platform enables high-efficiency singled or multiplexed knock-in/knockout of genes in mouse and sheep zygotes

期刊：Protein & Cell

作者：Weijia Mao, Pei Wang, Lei Zhou, Dongxu Li, Xiangyang Li, Xin Lou, Xingxu Huang, Feng Wang, Yanli Zhang, Jianghuai Liu, Yongjie Wan

发表时间： 20 January 2025

DOI：https://doi.org/10.1093/procel/pwaf006

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南京农业大学万永杰教授和张艳丽教授团队在 Protein & Cell 发表了题为“An upgraded nuclease prime editor platform enables high-efficiency singled or multiplexed knock-in/knockout of genes in mouse and sheep zygotes”的研究成果。该研究在基因编辑技术研究领域取得重要进展，成功利用升级后的核酸酶先导编辑器（uPEn）在湖羊中实现MSTN/PPARG双基因高效编辑，为畜禽基因编辑育种提供了新的技术手段。

AI视频导读

CRISPR-Cas基因组编辑技术的问世，为精准遗传操作打开了大门。在这一领域不断的探索中，2019年开发的“先导编辑”（Prime Editing，PE）技术实现了重要突破，其通过结合带有逆转录酶（RT）结构域的Cas9缺口酶融合蛋白和先导编辑向导RNA（pegRNA），在DNA上实现小型精准编辑。尽管PE技术展现出广泛的应用前景，尤其在畜牧育种领域，可用于引入有利基因型促进种质创新，但其在动物受精卵中的编辑效率较低，限制了实际应用。

研究的关键发现包括：

1. uPEn工具助力基因编辑效率提升

为了应对这一挑战，南京大学刘江怀教授团队与南京农业大学动物科技学院万永杰教授和张艳丽教授团队合作，尝试运用一种基于核酸酶PE变体（PEn）的新型工具uPEn。该工具集成了一个辅助DNA修复途径的调节模块（i53），在前期细胞实验中，uPEn展现出显著高于传统PE和PEn工具的编辑效率。

2. 小鼠模型验证uPEn的精准编辑

研究人员首先在细胞中对比了全长和拆分版本的uPEn，结果显示两种形式均能实现基因小片段的精准敲入。随后，团队将RNA形式的uPEn注射至小鼠受精卵中，成功在脂肪代谢相关基因Pparg（γ2）的上游插入优化Kozak序列，并获得了能够稳定遗传的编辑小鼠（founder）。纯合小鼠的F2代细胞中，PPARγ2蛋白表达显著上调，这一发现表明uPEn工具在基因表达调控中的潜在应用价值。

3. uPEn技术在湖羊基因编辑中的成功应用

接下来，研究人员在湖羊受精卵中用全长或拆分uPEn，分别针对PPARG基因进行Kozak基序敲入，同时靶向敲除MSTN基因。基因型分析结果显示，uPEn在PPARG处有效地敲入了Kozak基序（8/15羔羊，每只编辑羔羊的正确编辑率的中位数为50.11%），并且6只羔羊同时达成了双基因编辑（6/15），进一步证实了uPEn工具在多位点基因编辑中的强大灵活性。

图示：为了实现农场动物遗传改良的高效编辑目标，本研究探索了一种升级型的核酸酶PE（uPEn）。在初步证明其在小鼠受精卵中编辑成功的基础上，uPEn进一步被用于在胡羊中实现双位点敲入/敲除编辑。uPEn在绵羊受精卵中的稳健表现，确立了其作为牲畜遗传改良及其他领域有前途的工具的地位。

本研究成功获得了双基因敲入/敲除的湖羊，为进一步探索基因编辑对产肉量和肉质性状的影响奠定了基础。这些研究成果表明，uPEn技术在畜牧业种质创新中潜力巨大，为精准育种提供了全新工具。后期研究有待进一步降低uPEn核酸酶活性所导致的部分非准确编辑以及优化其编辑保真性。未来，基因编辑技术的持续发展将进一步推动精准育种和农业生产，为全球粮食安全和畜牧业可持续发展提供有力支持。

张艳丽 教授

南京农业大学

研究方向：动物胚胎工程；肉羊遗传育种与繁殖调控

刘江怀 教授

南京大学

研究方向：免疫监控与肿瘤；基因改造与细胞工程

万永杰 副教授

南京农业大学

研究方向：动物胚胎工程；肉羊繁育；羊业科学

期刊简介 About

英文学术月刊《Protein & Cell》致力于报道生命科学和生物医学领域的最新研究成果和前沿热点，维度跨越分子、细胞、模式生物、生物技术、基础与临床医学，研究对象涵盖微生物、植物、动物、人体，是一本国际化的综合性学术期刊。

自2010年创刊以来，《Protein & Cell》始终秉承主编团队的办刊理念，坚持全球开放获取（Global Open Access）出版，坚持及时公正地为全球学者尤其是青年学者的最新科研成果提供绿色通道（Green Channel for Rising Stars in Science）；同时，做到公平公正，在世界范围内积极推动生命科学发展，促进人类科技进步。