2024年9月25日，南京大学化学化工学院龙亿涛团队李孟寅副研究员等在Nature Chemical Biology期刊上发表了题为“Direct Mapping of Tyrosine Sulfation States in Native Peptides by Nanopore”的研究成果。该成果报道了一种基于纳米孔道单分子电化学技术的酪氨酸硫酸化蛋白质检测方法，成功实现对天然蛋白上酪氨酸硫酸化位置图谱的绘制及其所在片段氨基酸序列的精准鉴定。

南京大学化学化工学院李孟寅副研究员与龙亿涛教授为论文共同通讯作者，牛红艳（2020级博士）与李孟寅副研究员为共同第一作者。

酪氨酸硫酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，对蛋白质-蛋白质相互作用的调控及多种生理和病理过程至关重要。研究表明，约1%的酪氨酸残基可能被硫酸化，然而，由于检测方法的限制，迄今为止仅有约160种酪氨酸硫酸化蛋白质被实验鉴定，大量重要硫酸化蛋白及其功能有待发现与阐明。目前，酪氨酸硫酸化检测的难点主要在于三个方面：首先，酪氨酸硫酸化对温度和pH敏感，容易在质谱检测中丢失；其次，酪氨酸的另一种翻译后修饰——磷酸化，与硫酸化仅存在微小的分子量差异（0.0095 Da），使得检测的特异性和灵敏度都受到限制；此外，硫酸化蛋白质的极低丰度，以及其在纯化分离过程中的不稳定性进一步增加了检测的复杂性和难度。因此，亟需发展一种单分子分析技术，能够直接且精准地鉴定天然蛋白中的酪氨酸硫酸化状态，以解决该领域的关键性测量问题。

针对这一难题，研究团队基于纳米孔道单分子检测技术，创新性地发展了一种通用型的蛋白质酪氨酸硫酸化检测方法，能够在无需纯化分离的条件下，直接鉴定并定量混合体系中的低丰度硫酸化酪氨酸。基于团队二十年来对纳米孔道传感机制的独到理解，通过调控纳米孔道的静电势垒控制分子穿孔过程，精准设计了酪氨酸硫酸化基团与纳米孔道传感区域的特异性相互作用，突破了现有纳米孔道检测技术仅适用于测定特定已知多肽序列、难以应用于实际未知蛋白质分析的局限，在不受多肽序列干扰下可快速测量酪氨酸硫酸化状态。同时，结合全原子分子动力学模拟，团队验证了硫酸化诱导的非共价相互作用增强机制，证明了这种纳米孔道序列非依赖性硫酸化识别策略的可靠性。

图1：基于纳米孔道的酪氨酸硫酸化状态鉴定。

图2：基于分子动力学模拟的纳米孔道酪氨酸硫酸化状态检测机制探究。

进一步，研究团队基于纳米孔道单分子电化学技术对多种天然硫酸化多肽序列的鉴定，通过归一化相互作用因子，将离子流信号的差异与分子体积排阻特性直接对应，揭示了多肽硫酸化信号与其分子量之间的定量关系。这一发现将纳米孔道单分子电化学测量技术从简单的合成多肽片段的质量差异区分提升至鉴定天然多肽分子量的水平。

在此基础上，研究团队建立了一种通用的天然蛋白质酪氨酸硫酸化鉴定框架，也就是利用硫酸化修饰的相对不稳定特性，发展特异性的多肽去硫酸化策略，对比去硫酸化前后离子流信号的差异，直接识别并定量蛋白质样本中的硫酸化水平，鉴定硫酸化修饰所在片段的氨基酸序列。该方法已成功应用于水蛭素蛋白中酪氨酸硫酸化及对应多肽片段序列的识别。

图3：非序列依赖性的多肽酪氨酸硫酸化识别。

图4：蛋白质中酪氨酸硫酸化的鉴定。

利用纳米孔道逐一读取单个分子的特性，该技术避免了系综测量中大量分子平均信息的干扰，在无需蛋白质分离纯化的情况下，直接检测出了低丰度硫酸化多肽；同时，基于相互作用增强的纳米孔道传感原理，该检测原理不受多肽翻译后修饰基团的分子量影响，能够精准识别同一位点的酪氨酸硫酸化或磷酸化修饰。

图5：酪氨酸硫酸化与磷酸化的区分。

基于纳米孔道单分子电化学技术的酪氨酸硫酸化直接鉴定方法的成功建立，为进一步鉴定未知的酪氨酸硫酸化蛋白质提供了强有力的分析工具，并将助力深入研究硫酸化在生理和病理过程中的关键作用。（来源：科学网）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41589-024-01734-x