来源:Quantitative Biology 发布时间:2022/12/14 16:23:44
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QB|前沿综述:图像分析在植物染色体和染色质结构研究中的应用

论文标题:Applications of image analysis in plant chromosome and chromatin structure study

期刊:Quantitative Biology

作者:Nobuko Ohmido, Astari Dwiranti, Seiji Kato, Kiichi Fukui

发表时间:08 Oct 2022

DOI:10.15302/J-QB-021-0285

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染色体核型分析对遗传进化和多样化的研究有重要作用,详细的染色体图谱被认为有助于植物育种,并帮助生物学家进行基本的生物学和遗传学研究。图像分析在染色体核型研究中应用广泛,然而通过计算机技术对染色质结构图像进行客观分析存在诸多困难。近日,来自日本神户大学的Nobuko Ohmido团队系统地介绍了测量和评估植物染色体和染色质结构的一系列计算方法。相关论文“Applications of image analysis in plant chromosome and chromatin structure study” (点击文末“阅读原文”下载PDF全文)发表在Quantitative Biology期刊上。

全文概要

植物基因组研究中广泛的可视化程序的应用对于获得基因组及其进化的定量数据至关重要,为了开发染色体图谱,一种既能进行客观分析又能避免人类主观判断和模糊表达的图像分析方法是非常有效的。在本综述中,作者评估了图像分析技术的数字化效果;染色体和染色质的定量分析包括连接染色质构象的正确位置信息。另外,作者还描述了使用先进的氦离子显微镜对小染色体FISH图谱和核型、细胞核结构、纤维DNA和纳米级染色质结构的图像分析系统。最后,作者讨论了为植物染色体和染色质结构开发的一个有效图像分析应用程序。

植物小染色体的核型成像

作者首先介绍了在小染色体的植物中应用聚合(CP)模式和CHIAS系列方法构建定量染色体图谱的研究。植物(如禾本科和豆科)的小染色体在传统的带型分析方法(如N和C带状方法)中不显示清晰的条带。这是因为在有丝分裂期,微小且大小相似的染色体阻碍了对单个染色体的识别,染色体的形态学特征难以分析。

一种特征性的聚合模式(CP)已应用于水稻有丝分裂过程中染色体的观察。CP是染色质凝结区和非凝结区的区分。使用CP的特征作为图像分析的参数,可以识别染色体并构建定量的染色体图谱。莲花(Lotus japonicus)和红三叶草(Trifolium pratense L.)的染色体图也已经用CHIAS III制备。CHIAS仍在不断进行升级,目前最新版本是CHIAS IV。

通过CHIAS对染色体密度进行量化,对重复序列进行原位定位,通过FISH对基因和/或标记进行高分辨率测绘,有望促进对基因密度、片段复制和其他染色体重排的分析,并产生植物整合的染色体图谱。

细胞间期核内基因组大小和染色质构象的成像

基因组大小在植物和动物的进化中起着重要作用,因为基因组大小的变化可能伴随着对环境条件的进化适应。流式细胞仪被广泛用于利用荧光强度确定植物基因组大小,且间期细胞的图像分析对于了解染色质凝结的特征和细胞核的结构非常重要。

作者介绍了基因组大小和间期核型之间的关系:在大于4×104Mb基因组的2C值中,染色体以弦状方式穿过细胞核,在整个细胞周期中显示有Rabl取向。而在一些基因组小于1×10,000 Mb(2C值)的植物物种,如拟南芥和水稻,染色体在其间期细胞核中以扩散的形式存在,没有Rabl排列。尽管如此,植物中的DNA体积与核体积之比存在一个上限。事实上,DNA体积和核体积之间的恒定比率不应超过3%。

间期细胞核内的染色质核仁和三维结构成像

处于间期的细胞可以通过明显的形态特征和某些染色体区域的分布模式来描述,如染色质核仁(CCs)。处于间期的细胞在其异染色体CCs中表现出不同的分布模式,这可以作为植物中每个品系、物种或属的细胞学特征指标。然而,通过在显微镜下检查细胞核,很难客观地确定静止染色体的类型大小。获得核内核仁的可重复性和定量数据是客观分型最困难的部分。

静止染色体类型的图像数据可分为四个参数:CC的数量,CC的面积,CC在核内总面积的百分比,以及CC的分布。使用传统的醋酸地衣红染色方法,兰科植物的间期核显示出许多不同大小的CCs。以前的报道中应用了一种自适应阈值法,该方法经过非锐化掩膜过滤的修改。此外,该方法可用于分析CCs在相间核中的分布模式。CCs的数值参数可以为植物多样性的系统发育研究提供有用的遗传信息。

作者在有丝分裂和减数分裂前期曾观察到亲代着丝粒行为。为了确定亲代细胞核中两种着丝粒信号集之间的分离,需要使用3D成像技术。这种技术可以测量并计算观察到的细胞核和数字模拟细胞核中一种物种的着丝粒与另一种物种着丝粒之间的平均最近距离。

为了将核结构和功能联系起来,需要使用成像工具来量化核形态以及染色质区域在3D中的定位和组织。NucleusJ插件可以进行间期细胞核的3D图像分析,它是Java语言的ImageJ插件,作为ImageJ平台的jar文件发布。该插件使用来自单个图像或大型数据集的3D定量测量技术,可鉴定核的形状、大小、核内物质及其在核内的位置。NucleusJ对于有兴趣量化核、核物质或染色质区域的大小、形状以及后者在核空间中的定位的用户是很有帮助的。NucleusJ也可用于分割FISH信号。升级版的NucleusJ 2.0还可用于表征当植物突变体中核形态和染色质结构发生强烈改变时,用DNA染料染色或用3D-DNA FISH标记的细胞核。

间期细胞核内的环境表观遗传学成像

染色质核仁(CCs)在细胞核内呈分散状态,并且异染色质仅局限在染色体的着丝粒周围和核仁区域。这种明显的特点使得研究间期核内单个染色质结构域的空间排列和功能特性成为可能。表观遗传标记,如DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化,在植物细胞生长和发育中发挥着重要作用。分化细胞表现出相对复杂的组蛋白修饰模式,而干细胞表现出较少和更简单的修饰。荧光蛋白通常用于显示特定的核蛋白,免疫染色也可用于可视化特定分子的修饰,如甲基化胞嘧啶和特定核蛋白的发育过程、光反应和非生物应激反应。染色质可塑性被认为与植物对环境变化的适应有关。

特定的表观遗传学变化与植物的生长和发育有关。组蛋白H4乙酰化(H4K5ac)、组蛋白H3甲基化(H3K4me2和H3K9me2)和5mC在大麦分生组织中具有独特而特殊的模式。异染色质标记物H3K9me2在分化细胞、边界分生-延伸区和表皮细胞中有较高的浓度;然而,5mC在根冠和远端分生组织中占优势。在近端分生组织区域,两种异染色质标记都不丰富。然而,大多数异染色质标志物(H3K5ac和H3K4me2)高度集中在经历高度活跃的细胞分裂的分生组织周围区域。

DNA纤维拉伸的成像

染色质纤维的基本单位是核糖体,它由大约147bp的DNA单位盘绕在八聚体组蛋白分子(H2A、H2B、H3和H4的两个亚单位)的核心上,与连接体组蛋白H1相关。核糖体单元与其他单元连接,形成10纳米的纤维,被称为 "串珠"。植物中高度浓缩的体细胞中期和粗线期染色体的FISH分辨率估计分别为4–5Mb和1.2Mb,因此,两个相距小于1Mb的DNA序列不能可靠地解析。为了增加光镜分辨率的光学限制(大约小于100纳米),例如结构化照明显微镜(SIM)、光激活定位显微镜(PALM)、随机光学重建显微镜(STORM)和刺激发射耗损显微镜(STED)提供了对DNA和蛋白质的分子结构、相互作用和功能的新见解。

除了超分辨率显微镜,还可以从体细胞中提取延伸的染色质纤维(EDFs)。纤维-荧光显微镜可用于实现最高分辨率的相邻DNA序列的映射,其距离仅为1kb。Fiber-FISH被成功地用于对拟南芥、水稻、番茄和甜菜的染色体域进行详细研究。多色纤维-荧光显微镜可用于测量植物染色体重复区的DNA序列之间的物理距离,这些序列在基因组测序项目中无法被组装。EDF和细胞核中的DNA或蛋白质的信息可以通过视觉观察,也可以用图像分析方法进行定量分析。

CHIAS-Straight可以用来对EDF的纤维信号进行定量分析(图1)。CHIAS-Straight是一个免费的应用程序,用于测量纤维-FISH和免疫染色纤维的成像性能。该软件由Ohmido实验室开发,可以在实验室网站进行下载和安装。

图1. CHIAS-Straight的工作流程

Fiber-FISH方法还可用于研究mtDNA插入物。在真核生物中,mtDNA自然转移到细胞核中会产生核mtDNA拷贝,人类体细胞就含有成千上万的mtDNA拷贝。这些mtDNA插入物来自复杂的复制和丢失事件,无法用传统的方法,如PCR或southern blot杂交来表征。因此,Koo和他的同事开发了纤维荧光显微镜成像,进行mtDNA重复计算,以分析整个人类基因组中核mtDNA的插入。这种方法被称为mtDNA FIBER-FISH,并被用于癌症细胞系和原发性肿瘤以及推进基础和转化性癌症研究。

植物染色体的纳米结构成像

染色质纤维的压实导致核小体的形成,核小体由一个DNA单元盘绕着与连接体组蛋白分子相关的核心组成。更高水平的染色质纤维以浅层超卷的30纳米结构出现,被称为螺线管。氦离子显微镜(HIM)或扫描氦离子显微镜是一种最先进的纳米制造成像技术,它利用了氦离子在样品表面相互作用的正电荷。由于有足够的二次电子(SE)和低光束损伤,这项技术不需要金属涂层,因此HIM是一个强大的工具,用于纳米级的成像以及生物软样本表面的分析。然而,HIM还没有被用来研究植物染色体的结构。

染色体可以用高分辨率的扫描离子显微镜和基于扫描氦离子束的HIM成像技术来观察。以大麦染色体的观察为例,作者将分析过程分为若干个步骤(图2)。使用HIM图像定义染色质纤维的区域(步骤1至3)(图2-C)。然后在染色质区域画出中线(步骤4和5)(图2)。在步骤6至8中,染色质纤维的宽度线被画在与中线垂直的位置(图2)。最后,测量染色质区域的宽度线的大小(步骤9)。宽度线根据其长度用各种颜色表示(图2)。

图2. 基于测量HIM图像染色质纤维直径的程序的图像分析

据报道,凝聚的染色质的完整性取决于阳离子的结合。为此,CHIAS被用来定量测定因阳离子耗尽而弯曲的染色体被拉直后Ca2+和Mg2+耗尽的效果。使用CHIAS IV成功地拉直了弯曲的染色体。这种拉直也可以提供有关染色体的定量数据。

光学成像分析在新植物基因组研究中的应用

最后,作者介绍了一系列利用成像方法进行基因组测绘的研究和应用场景。通过光纤-FISH成像分析,利用植物基因组的光学测绘技术进行下一代基因组测绘,使基因组组装达到 "接近完成 "的水平,以进行可靠和详细的基因注释和结构变化评估。光学绘图也可以应用于动态染色体结构变异(SV),如倒位、缺失、易位和复制。光学图谱还应用于大规模支架的下一代序列所调查的基因组组装,包括通过结合基因组图谱数据对contig方向和空白区域的准确长度信息,然后对错误的组装数据进行修正。

最近的一个重要发展是基于合成寡聚物的FISH探针的应用。基于寡聚物的探针可以从重复的DNA元素或从单拷贝的DNA序列中设计出来,这是对传统的使用克隆DNA序列的FISH探针的范式转变。对特定染色体区域或整个染色体特异性的合成寡头可以通过计算确定,平行合成,并进行荧光标记。从一个物种的保守DNA序列设计的寡聚物探针可以在遗传相关的物种中使用,允许比较细胞遗传学绘图。合成寡聚物探针的进展将大大扩展FISH在许多植物和农作物物种中的应用。

另外,RNA引导的核酸内切酶原位标记(RGEN-ISL)被报道为替代FISH的可视化方法。RGEN-ISL是一种使用CRISPR/Cas9系统对重复性DNA序列进行可视化的简单方法。它用途广泛,使用简单,已被用于可视化细胞核或染色体中的DNA序列,而没有破坏细胞学样本结构的变性过程。

QB期刊介绍

Quantitative Biology (QB)期刊是由清华大学、北京大学、高教出版社联合创办的全英文学术期刊。QB主要刊登生物信息学、计算生物学、系统生物学、理论生物学和合成生物学的最新研究成果和前沿进展,并为生命科学与计算机、数学、物理等交叉研究领域打造一个学术水平高、可读性强、具有全球影响力的交叉学科期刊品牌。

QB期刊目前已被ESCI, Scopus, CSCD等国内外重要数据库收录。Citescore2021=4.6,预计2023年将获得第一个影响因子(IF)。

《前沿》系列英文学术期刊

由教育部主管、高等教育出版社主办的《前沿》(Frontiers)系列英文学术期刊,于2006年正式创刊,以网络版和印刷版向全球发行。系列期刊包括基础科学、生命科学、工程技术和人文社会科学四个主题,是我国覆盖学科最广泛的英文学术期刊群,其中13种被SCI收录,其他也被A&HCI、Ei、MEDLINE或相应学科国际权威检索系统收录,具有一定的国际学术影响力。系列期刊采用在线优先出版方式,保证文章以最快速度发表。

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