北京时间2025年10月3日，《科学》（Science）杂志在线发表了中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队与中国科学院微生物研究所邱金龙团队合作的题为“Engineered geminivirus replicons enable rapid in planta directed evolution”的研究论文。

研究团队合作对双生病毒复制子进行工程化改造，首次在植物底盘中构建了快速且通用的体内定向进化系统GRAPE (Geminivirus Replicon-Assisted in Planta Directed Evolution)，并利用该系统实现了植物免疫受体NRC3和Pikm-1的体内定向进化，为植物基因和蛋白的工程化改造提供了性能强大的高通量技术平台。

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高效培育高产抗逆作物新品种是保障粮食安全的重要策略，优异等位基因是作物新品种培育的核心遗传基础，但现有基因资源已难以满足日益提升的育种需求。定向进化技术能在短时间内为目的基因赋予改进的或全新的生物学功能，可快速地生成育种所需的优异等位基因，因而有望成为突破作物育种遗传资源瓶颈的有效途径。

目前，微生物及动物细胞中已建立多种定向进化系统，但这些系统通常不适用于植物基因。这是由于植物基因的功能往往依赖植物特有的翻译后修饰、分子间相互作用及调控网络，在非植物体系中难以维持天然活性。因此，许多植物特异性基因和功能无法在异源系统中有效表征。然而，当前尚无直接在植物体内实现定向进化的系统。

在植物中搭建定向进化系统，其主要挑战在于：除分生组织外，植物其他部位的体细胞普遍增殖缓慢，这一特性会显著制约定向进化过程中所需的突变积累与筛选效率。为解决这一问题，研究团队创新性地借助双生病毒（Geminivirus）——这类植物单链环状DNA病毒具备通过滚环复制在植物细胞中快速扩增的特性——开展研究。团队提出核心设想：若将目的基因的预期生物学功能与病毒的滚环复制机制相偶联，便可依托病毒高效的DNA扩增能力，快速完成基因变体的筛选与富集，最终实现目的基因在植物体内的定向进化。

为了实现这一设想，研究团队首先对双生病毒复制子进行工程化改造，实现滚环复制过程与基因功能的偶联。基于人工病毒复制子，研究团队进一步开发了高效的植物体内定向进化系统GRAPE：体外诱变目的基因，并构建成复制子文库；根据目的基因的生物学功能设计遗传通路，使其与复制子的滚环复制正向或负向偶联；通过农杆菌渗入法将复制子文库导入本氏烟叶片，让文库在叶片内完成复制和筛选；深度测序计算每一个目的基因变体在文库中的占比变化——促进复制的变体会得到富集，而抑制复制的变体则被淘汰。

利用GRAPE系统，研究团队成功实现了多种植物免疫受体的快速定向进化。植物NLR免疫受体是免疫系统的核心组分，其激活会引发超敏细胞死亡，而这一反应难以在微生物或动物细胞中进行表征，制约了这类蛋白的功能优化与新功能开发。利用GRAPE平台，研究团队对茄科中关键的辅助NLR蛋白NRC3进行了定向进化，借助细胞死亡将NRC3的功能与复制子的滚环复制相偶联，获得了一系列保留免疫活性的同时可以不受线虫效应蛋白SPRYSEC15抑制的NRC3变体。

此外，针对水稻整合诱饵型NLR免疫受体Pikm-1，研究团队利用GRAPE进行两轮迭代定向进化，获得了可以同时识别稻瘟菌AVR-Pik效应子6种亚型并激发免疫反应的Pikm-1变体，系统拓展了Pikm-1的效应子识别谱。该策略为抗病作物育种创造了宝贵的遗传资源。

研究团队已证实，GRAPE亦具有对众多不同基因实现功能进化的潜力。双生病毒复制子的滚环复制可与多个目的基因的生物学功能形成正向偶联：如内含肽、序列特异性蛋白酶与重组酶，这类基因能通过正选择实现功能进化；同源重组因子、序列特异性核酸酶等可与滚环复制形成负向偶联，进而通过负选择实现功能的定向进化。这些研究结果进一步验证了GRAPE系统的通用性，也展示了其作为高度适配植物体内环境的蛋白质工程平台的应用潜力。

图：植物体内定向进化系统（GRAPE）示意图及其应用

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综上所述，研究团队基于工程化改造的双生病毒复制子，首次在植物体内建立了高效定向进化系统。该系统可在单张本氏烟叶片上，于4天内完成对多达105个目的基因变体的筛选。由于整个筛选过程均在植物体内进行，其进化产物无需额外优化即可直接应用。GRAPE系统为加速植物分子育种与合成生物学研究提供了快速、高效的技术平台，也为植物基因及蛋白的工程化改造开辟了全新技术路径。正如审稿人所评价的：“该研究的独特之处在于建立了植物体内定向进化方法，填补了当前植物生物学领域的一项重要空白。该技术进步有望对这一快速发展的研究领域产生重大影响。”

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员、中国科学院微生物研究所邱金龙研究员为论文的共同通讯作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所博士后祝皓诚、微生物研究所已毕业博士生覃旭、遗传与发育生物学研究所博士研究生魏乐妍、博士后姜丹丹为该论文的共同第一作者。

中国科学院遗传与发育生物学研究所硕士研究生张巧、博士后王文乾、助理研究员梁荣洪、副研究员张瑞、副研究员陈坤玲、北京齐禾生科生物科技有限公司首席技术官赵天萌、高级科学家张康、高级科学家刘关稳在课题研究中做出了重要贡献。中国科学院微生物研究所叶健研究员为本研究提供了重要实验材料。

该研究得到了国家自然科学基金、北京市乡村振兴农业科技项目、生物育种国家科技重大专项、国家重点研发计划、新基石科学基金等项目的资助。

相关论文信息：https://www.science.org/doi/10.1126/science.ady2167