■本报记者 鲁伟 通讯员 林毅 张志凌

病毒性疾病严重威胁着人类健康，深刻认识和理解病毒感染过程及致病机制是病毒性疾病防治的重要基础。研究病毒感染过程通常基于荧光标记技术，但是常用的荧光蛋白及传统荧光染料往往容易发生光漂白，难以长时间动态跟踪整个感染过程。

在“纳米研究”国家重大科学研究计划的支持下，围绕“量子点标记技术研究病毒侵染过程及宿主应答”项目，来自武汉大学，中国科学院武汉病毒研究所、长春应化所、深圳先进技术研究院，以及北京理工大学等单位的专家，自2011年1月开始开展了有益的探索，并取得了重要进展。

据该项目首席科学家、武汉大学化学与分子科学学院教授庞代文介绍，以半导体荧光量子点为代表的性能优异的纳米标记材料，可望克服现有荧光标记材料的不足，为实时动态跟踪病毒感染宿主细胞这一复杂的动态生物学过程提供新途径。

新型纳米标签

为了研究病毒感染过程，就需要荧光标记。一般来说，活细胞或活体示踪要求所用的荧光标记材料在复杂的生物环境中具有良好的稳定性，能产生稳定、可靠的检测信号，才不会“走丢”或“隐身”。并且，还要求在最大程度上降低对所标记对象的影响，以获取生命过程的真实信息。

“也就是说，虽然身上贴了标签，但其本人并无察觉，心情依旧，行为如常。既然如此，就要求所选用的标记材料具有尽可能小的尺寸、良好的生物相容性及稳定性，能发出足够强的示踪信号。”在庞代文看来，量子点就算得上这一类令人满意的“标签”，具有粒径小（通常可小至几纳米）、亮度高、光稳定性好等独特性能，且能实现多色同时标记，同时跟踪多个对象。

采用纳米标记技术，特别是量子点标记技术对病毒感染宿主过程进行诠释，将有望克服现有技术的不足，科学诠释病毒致病机制。但是，如何精确控制材料的性质，制备出尺寸小且性质稳定的量子点，依然是该领域的一大难题。

此外，为了降低生物成像中背景信号的干扰、激发光对生物体的光毒性以及增加荧光的穿透深度，理想的标记材料应具有较长的激发波长，荧光发射波长也最好在近红外区且具有高的荧光强度。

基于此，武汉大学研究团队提出了“在时间和空间上耦合活细胞内并无关联的生物化学反应途径”合成纳米材料的“时——空耦合”调控合成新策略，利用活酵母细胞成功可控地合成出多色荧光量子点纳米标记材料，让细胞为科学家们做了一件几乎不可能做到的事。

他们将烦琐危险的化学操作演变为仅仅培养细胞，将通常在约300℃进行的合成演变为在30℃下的活细胞内完成，且不需要任何易燃、易爆、有毒溶剂。进而，他们又提出了“准生物合成”策略，利用细胞外的模拟体系成功合成出多种小粒径的近红外量子点，成功地化解了难题。

让病毒亮起来

庞代文告诉记者，病毒很小，若要监视其一举一动非常困难，如果是在复杂的生物背景之下，那更是一片漆黑。而荧光标记能让病毒亮起来，方便地实现跟踪。

中国科学院武汉病毒研究所研究员肖庚富的团队制备出均一稳定的发光病毒样颗粒，并跟踪了其“感染”细胞的过程。他们还实现了量子点对艾滋病慢病毒（HIV）的标记，也能用量子点定点标记昆虫病毒内部的结构。

由于包膜病毒广泛存在于自然界且与人类健康密切相关，这一研究受到了很大的关注。而包膜病毒结构较为复杂，通常由包膜、衣壳及核酸等构成。由武汉大学和中国科学院武汉病毒研究所的研究者们进行合作，利用绿色荧光蛋白标记杆状病毒包膜，核酸分子光开关钌的含氮杂环配合物在病毒复制过程中自然嵌入核酸中标记病毒核酸，成功实现了对病毒包膜和核酸的双重标记。

此外，北京理工大学和中国科学院武汉病毒研究所的专家团队合作提出顺应自然的病毒的温和标记策略。他们利用细胞中胆碱磷脂自然的生物合成和代谢嵌入机制、病毒从宿主细胞膜获取磷脂成分形成包膜的生物学特点以及病毒核酸的“复制嵌合”，在病毒自然复制过程中实现了病毒核酸和包膜的双重标记（双重标记效率高达85%）。

“这将有助于研究人员看到病毒感染过程中更多的行为细节。”庞代文表示，量子点标记技术能让病毒持续变亮，为监测单个病毒侵染宿主细胞的一举一动创造了条件。

看到病毒感染过程

病毒是严格寄生的微生物，寄生于宿主并借助宿主细胞完成自身“繁衍”。病毒在细胞中的感染由三个基本过程构成循环，即进入宿主细胞（侵染）、基因组复制/组装和出胞，并进一步感染其他细胞。

该循环是病毒维持繁衍生息的关键，而侵染是其中的首要步骤。基于量子点标记，武汉大学团队获取了病毒感染过程的实时动态信息，如病毒运动方向、路径、速率、“扩散”系数等，以及各种运动模式；研究了禽流感病毒在活细胞内的动态行为及机制，并对流感病毒侵染宿主细胞典型运动轨迹进行分析，发现病毒侵染过程错综复杂。

中国科学院长春应用化学研究所团队发现乙肝病毒表面抗原（HBsAg）通过小窝蛋白介导的内吞途径跨膜，实现了病毒感染活细胞过程的高分辨、高灵敏、多维动态示踪，展示出纳米生物技术良好的应用前景。

最近，中国科学院深圳先进技术研究院团队研究出近红外量子点标记病毒感染活体动物的非侵入示踪技术；成功地长时间跟踪了禽流感H5N1假病毒对小鼠的感染过程。