论文标题：Development of an Engineered Sugar Aminotransferase with Simultaneously Improved Stability and Non-Natural Substrate Activity to Synthesize the Glucosidase Inhibitor Valienamine

期刊：Engineering

DOI：https://doi.org/10.1016/j.eng.2024.04.026

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上海交通大学生命科学技术学院崔莉团队在《Engineering》发表了一篇题为“Development of an Engineered Sugar Aminotransferase with Simultaneously Improved Stability and Non-Natural Substrate Activity to Synthesize the Glucosidase Inhibitor Valienamine”（同时提升糖氨基转移酶热稳定性及对非天然底物催化活性实现糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺的高效合成）的研究成果，王润希、乔路、刘慕非为论文共同第一作者。研究团队针对糖氨基转移酶WecE的性能瓶颈，通过定制化的酶分子进化策略，为糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺的生物合成提供了新方案。

论文指出，糖氨基转移酶（SAT）可在特定酮糖的结构上引入氨基，生成具有生物学活性的氨基糖，这一特性已被应用于氨基糖的人工设计合成。例如，利用糖氨基转移酶WecE将井冈霉烯酮转化为高价值的α-葡萄糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺。然而，WecE的低热稳定性及其对非天然底物催化活性不足限制了其应用，受限于广泛存在的酶稳定性-活性权衡（stability-activity trade-off）效应，同时提升酶热稳定性和催化活性具有技术挑战性。

图1 WecE催化的氨基转移反应。（a）大肠杆菌MG1655中WecE催化的天然转氨反应；（b）WecE催化的人工反应，其中非天然底物井冈霉烯酮转化为井冈霉烯胺。

为实现 WecE 热稳定性和催化活性的高效进化，论文还提到，组合活性中心饱和突变（CAST）和迭代饱和突变（ISM）策略已被应用于一些ω-氨基转移酶的性能进化，例如，Novick等对来自Vibrio fluvialis JS17的氨基转移酶ATA-217活性中心底物结合区域的残基进行了进化，大幅提高了其对沙库巴曲手性前体的催化活性；此外，Jia等对一种R构型选择性的氨基转移酶（Capronia epimyces TA）活性中心大底物结合口袋中的残基进行了饱和突变与组合突变，获得了催化活性和热稳定性都显著提升的突变体。然而，迄今为止，还没有利用CAST或其他方法对糖氨基转移酶进行热稳定性-催化活性工程化改造的研究报道。基于此，研究团队使用进化保守性和平均突变折叠能等指标对 WecE 活性中心57个氨基酸残基进行评估，筛选到14个有助于同步提升热稳定性和催化活性的潜在热点，并采用组合活性中心饱和突变-迭代饱和突变（CAST-ISM）策略针对热点残基进行了正向突变筛选和迭代组合。

研究结果显示，与WecE野生型相比，第四轮迭代突变体M4（Y321F/K209F/V318R/F319V）在40℃的半衰期提高了641.49 倍，对非天然底物井冈霉烯酮的催化活性提高了31.37倍；第三轮迭代突变体M3（Y321F/K209F/V318R）在40℃的半衰期提高了 83.04倍，对井冈霉烯酮的活性提高了37.77倍。在 50mg 制备规模的井冈霉烯胺预制备酶法合成实验中，使用10 mg/mL纯化的突变体M3、M4 和野生型 WecE，在20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.5）、37℃、50 r/min条件下反应12h，每隔2h通过OPA柱前衍生化-高效液相色谱分析法检测产物井冈霉烯胺的生成，结果显示在总时长12h的反应结束时，M3和M4的井冈霉烯胺产量分别是野生型WecE的20.03倍和17.67倍。

图2 WecE活性中心氨基酸残基保守性分析。（a）WecE根据Consurf保守性评分（1~9分，分数越高表示保守性越强）进行着色，其表面图示展示了WecE（PDB ID: 4ZAH）活性位点中与共结晶外部醛亚胺过渡态TDP-Glc4O?PMP接触（距离< 8 Å）的残基；（b）WecE（PDB ID: 4PIW）中通过共价键和氢键与内部醛亚胺过渡态LLP相互作用的残基具有高度保守性（Consurf保守性评分≥ 8）；（c）对57个与井冈霉烯酮-PMP外部醛亚胺过渡态距离在8 Å内的接触残基进行变异性分析，根据保守性评分阈值8将其分类为39个可变残基和18个不可变残基。

图3 饱和突变的ΔΔG分布及其对稳定性影响评估。

图4 使用定点饱和突变构建组合活性中心饱和突变库，确定提升热稳定性和催化活性的突变位点。

对于催化性能提升的机制，论文分析表明，与野生型相比，热稳定性和催化活性同时提升的突变体蛋白界面相互作用增强、氨基转移反应亲核进攻催化距离缩短。通过分子动力学模拟研究发现，突变体M3和M4活性中心的形状和静电势发生了改变，平均模拟结构的二聚体界面面积增加，相应底物结合口袋的体积减小，界面相互作用显著加强，同时伴随着盐桥（SB）和氢键（HB）相互作用的增加，这些变化有助于亚基间的组装，从而增强多聚体酶分子的稳定性并保护蛋白质免受分解。此外，WecE活性中心保守的K181作为亲核进攻的催化残基，在晶体结构中与PLP形成内部席夫碱，利用分子动力学模拟计算发现，与野生型WecE相比，突变体M3和M4中K181的ε-氨基到井冈霉烯酮-PMP中间体C=N键的N原子的催化距离更短，而活性中心保守赖氨酸残基对外醛亚胺的亲核进攻需要与反应原子非常接近，这种距离缩短有利于亲核进攻，进而提升催化活性。

图5 以野生型WecE为起始的稳定性-活性进化途径，以及突变体M3、M4与野生型WecE的井冈霉烯胺预制备比较。（a）在CAST过程和ISM循环中，WecE从野生型出发对非天然底物井冈霉烯酮的稳定性和活性同步进化路径；（b）在50 mg制备规模反应中，对表现最佳的突变体M3、M4以及野生型WecE在12 h内的井冈霉烯胺产量进行了测定。

图6 突变体M3、M4和野生型WecE的结构特征及界面相互作用分析。（a）野生型WecE及其突变体M3和M4活性位点的静电势表面由红色（酸性特征）向蓝色（碱性特征）过渡，并与外部醛亚胺井冈霉烯酮-PMP结合，使用PDBsum检测的结合位点界面面积和体积已在相应结构上标注；（b）在100 ns MD模拟期间界面处涉及的SB和HB相互作用的累计数量；（c）MD模拟期间参与界面HB相互作用的突变残基总数；（d）野生型WecE与突变体M3和M4的RoG、SASA以及MM/PBSA受体能量值。

图7 突变体M3和M4以及野生型WecE与外醛亚胺井冈霉烯酮-PMP的催化距离和特性分析。（a）在野生型WecE、突变体M3和M4的分子动力学模拟过程中，分析了K181残基ε-氨基与井冈霉烯酮-PMP中间体C=N键氮原子之间的催化距离（蓝色虚线）以及平均构象的相互作用（灰色虚线）；（b）MD模拟期间井冈霉烯酮-PMP HB相互作用的累计数量及参与HB相互作用的残基数；（c）MD模拟中由突变残基和催化残基K181贡献的蛋白质-配体HB相互作用累计数量；（d）野生型WecE与突变体M3、M4和井冈霉烯酮-PMP复合物的LCSA能量与MM/PBSA结合能。

该研究提供了一种热稳定性-催化活性热点评估的通用策略，为氨基糖类化合物的人工生物合成提供高稳定性和高催化活性的糖氨基转移酶，也为今后改造生物合成途径中的酶以及开发新生物合成途径奠定了基础。井冈霉烯胺作为类寡糖化合物的代表，具有多种生物学活性，是抗糖尿病药物阿卡波糖和抗水稻纹枯病药物井冈霉素A的功能单元，其结构与葡萄糖类似，具有出色的糖苷酶抑制作用，可作为新药开发的功能性前体，该研究成果将为井冈霉烯胺的规模化高效合成提供有力支撑。

论文信息：

Runxi Wang, Lu Qiao, Mufei Liu, Yanpeng Ran, Jun Wang, Wupeng Yan, Yan Feng, Li Cui. Development of an Engineered Sugar Aminotransferase with Simultaneously Improved Stability and Non-Natural Substrate Activity to Synthesize the Glucosidase Inhibitor Valienamine. Engineering, 2024, 42(11): 194-205 DOI:10.1016/j.eng.2024.04.026

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