导读

近日，美国西北大学的研究团队开发了一种染色质中的三色单分子定位显微镜（SMLM），所提出的顺序免疫标记协议能够在高密度的核环境中可靠地进行三色研究，结合多路定位数据集和强大的分析算法，揭示了异染色质和常染色质并非截然分开的领域，而是转录和常染色质的定位与异染色质团簇的外围相耦合。这一发现为分子成像技术在密集核环境中的应用迈出了关键一步，多标签成像能力的提升将有助于更准确地研究染色质等多组分复杂系统，为解析染色质的组织结构和功能关系提供了全新视角。该成果以Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin为题发表在国际顶尖光学期刊《Light: Science & Applications》。

研究背景

染色质作为基因组的三维折叠结构，其组织状态直接影响基因表达与调控，在维持细胞功能和生命活动中扮演核心角色。染色质具有明显的层级结构，从核小体（约11纳米）到超核小体结构（约50-200纳米），再到染色体领区和核内功能域，其组织状态受多种表观遗传标记的调控，例如组蛋白修饰和DNA甲基化。传统显微镜因受衍射极限限制，难以解析小于200纳米的细节结构。近年来，单分子定显微术（SMLM）和超分辨率显微技术的出现，极大推动了染色质研究。SMLM方法（如STORM、DNA-PAINT）通过定位单个荧光分子实现了10-20纳米的高分辨率成像。这使得研究者能够解析染色质的纳米级结构，揭示其与基因功能的关系。然而，核内染色质密集环境为多色成像带来了巨大挑战，包括抗体结合效率低、非特异性吸附增加、以及多重标记分析的复杂性。

然而，在核内环境中，染色质成像面临诸多挑战。核内染色质及相关分子高度密集，限制了抗体或探针的扩散，导致标记效率降低，并增加了非特异性结合的风险。而且，研究染色质的复杂功能需要同时标记多个目标分子，如异染色质、常染色质和RNA聚合酶II（RNAP II）。然而，现有技术难以实现稳定的三色标记。以往研究多局限于两色成像或依赖化学探针（如DNA-PAINT），但这些方法可能干扰染色质原始结构。此外，染色质作为一种无序聚合体，其纳米尺度的结构和空间关系难以通过简单的成像手段进行解读，需要更为复杂的算法来解析不同染色质状态之间的相互作用。

图1. 显示了在密集的核环境中相对于稀疏的细胞质进行多重标记的困难性。第一个面板显示了被抗体复合物标记的微管。在稀疏的环境中，抗体不受邻近结构的阻碍，可以到达目标。中间的图展示了在细胞核内获得抗体的困难，一些抗体到达内部并标记染色质，而大多数抗体位于核膜外。第三张图说明了在致密核内标记靶标的问题：抗体复合物I与其他核大分子反应所显示的交叉反应性，由于邻近而产生的串扰，以及由于高度拥挤而对非靶标表面的吸附。

研究亮点

研究团队采用三色SMLM成像技术，深入研究了异染色质、常染色质和RNA聚合酶的空间分布及相互关系。

异染色质核心周围的功能分布：研究显示，增强子相关的常染色质（H3K27ac）和活跃转录区（RNAP II）主要定位在异染色质（H3K9me3）簇的外围。异染色质较大的簇内部更靠近H3K27ac，而较小的簇周围则与RNAP II的结合更显著。

图2. 不同大小异染色质团簇的异染色质与常染色质、异染色质与功能性RNA聚合酶的二色距离分析。a–c二色分析：小(a)、中(b)和大(c)的RNAPII定位相对于异染色质簇外围的距离。d - f分别展示了相对于异染色质簇外围小(d)、中(e)和大簇(f)的H3K27ac定位的2色分析结果。

联合密度分析揭示新模型：三色联合密度分析表明，异染色质簇周围是转录活性区域的“界面”，而非孤立的功能区。常染色质簇（如H3K4me3标记的启动子区）则显示增强子和RNA聚合酶集中在簇内部，这与传统转录工厂的概念形成对比。

图3. HeLa 细胞中多标签 SMLM 成像联合密度分析显示，RNAPII和 H3K27ac 在异染色质簇外围共存，但在常染色质簇重叠。

染色质域的大小依赖性：随着异染色质簇的大小增加，增强子和RNA聚合酶的空间分布发生显著变化，提示染色质域的功能可能与其物理大小相关。

这些发现为染色质的分子结构和功能联系提供了更全面的视角，并挑战了传统的染色质功能分区模型。

未来展望

这一研究不仅展示了三色SMLM在染色质成像中的潜力，还提出了染色质功能组织的新模型。异染色质簇作为“组织中心”，增强子和转录活性区域围绕其外围分布，可能是基因调控的关键机制之一。未来，研究团队计划进一步扩展技术应用，包括观察染色质在转录激活和细胞分化中的动态变化的实时成像，以及比较正常与病理状态下染色质结构的差异，如癌症或遗传疾病中的染色质重塑，还可以结合更多分子标记，探索染色质与其他核内功能元件（如核小体或RNA分子）的相互作用。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-01786-1