导读

光学层析是一种利用光学方法（焦面共轭、焦内激发和调制照明等）提取焦面信号、滤除离焦信号，以实现三维物体清晰成像的方法。这一概念的提出与共聚焦显微镜的发明密切相关。1957年Minsky申请了共聚焦显微镜专利，使得科研人员能够在不对样本造成物理损伤的情况下，获取其单个层面图像，并通过逐层扫描完成对三维结构的观察和分析。光学层析的出现成为显微镜发展史的重要里程碑，在生命科学领域发挥着至关重要的作用。

近日，华中科技大学/海南大学骆清铭院士、袁菁教授团队与香港中文大学陈世祈教授团队在Light: Science & Applications上发表了题为“Optical sectioning methods in three-dimensional bioimaging”的综述文章。

文章首先从光学系统的离轴与共轴成像的新视角出发，对多种光学层析技术的原理及其发展进行了综述。随后，对这些基于不同原理的光学层析方法的性能进行了全面的评估，并根据不同的应用需求提供了相应的选择建议。文章最后探讨了离轴分离探测成像技术相较于共轴成像技术的优势，并分析了在同一光学系统中实现多种光学层析技术的可能性，指出这可能成为三维生物成像领域的一项创新性突破。

一．共轴与离轴光学层析方法

在生命科学的最新研究中，光学显微镜技术对于获取生物样本的三维结构和功能信息至关重要。然而，生物组织中的强散射和吸收现象常常导致三维成像质量受损，同时伴随着一系列挑战，如有限的时空分辨率、低信噪比、穿透深度不足以及光毒性强等。为了克服这些问题，科学家们已经开发了多种光学层析技术，包括点共聚焦显微镜、双光子显微镜、结构光显微镜和光片显微镜（见图1）。每种技术都有其独特的成像机制，适用于特定的应用场景。因此，针对不同的成像需求选择合适的光学层析技术变得极为重要，但也具有挑战性。

图1.现有光学层析方法系统示意图

在对现有的光学层析技术进行综合分析和归纳后，我们提出按照照明光轴与探测光轴是否重合分为共轴成像技术和离轴成像技术（图2所示）。通过观察系统的点扩散函数在xz平面的切面，我们可以发现，离轴成像技术在原始数据采集阶段就已经实现了对在焦信息和离焦信息的有效区分。这一特点使得离轴成像技术通常能够提供更优异的层析效果，特别适用于对厚生物样本进行成像。

图2.共轴成像与离轴成像示意图

二．光学层析方法选择指导

基于共轴与离轴成像的特性，我们为不同场景下生物样本的几何特征和特定需求推荐了相应的光学层析方法（图3）。在背景较低的薄样本或者分辨需求远大于分辨率的厚样本成像中，共轴成像系统和离轴成像系统都能提供相似的性能。由于共轴成像系统的普及性和操作便捷性，它在这些情况下更受青睐。然而，当需要对分辨需求接近分辨率的厚样本成像时，离轴成像系统展现出不可替代的优势。

图3.针对不同应用场景的推荐解决方案

三．光学层析方法的潜在发展方向

生物样本的多样性和实验目标的特异需求对成像技术提出了不同的挑战。为了适应不同的实验条件而频繁更换成像设备，不仅操作复杂，而且耗费时间。因此，开发一种能够在单一设备中集成多种光学层析技术的解决方案，具有重要的发展潜力。离轴分离探测将系统的点扩散函数进行拆分记录，为实现多种成像技术的集成提供了可能（图4）。未来，还可以进一步探索点扩散函数的重组，拓展更多光学成像技术，为生物学研究提供更为强大和灵活的工具。（来源：中国光学微信公众号）

图4.同一系统实施不同光学层析方法效果图

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-024-01677-x