导读

图像扫描显微镜（ISM）凭借其亚衍射极限成像能力，在神经科学、癌症研究等领域具有重要应用价值，但传统ISM所依赖的光学元件存在成本高、数值孔径（NA）受限、焦斑均匀性不足等问题，难以在高NA下生成密集且高质量的多焦点阵列。为解决这一问题，韩国成均馆大学Yongjae Jo等研究人员提出混合复用的新型多焦点超构透镜设计策略，成功研制出兼具高密度与高均匀性的多焦点超透镜，并在此基础上构建了多焦点超构透镜的图像扫描显微镜（MMISM），成像分辨率达到传统衍射极限的两倍，并能更清晰地呈现神经元的精细结构特征，为神经科学等领域的深度研究提供了性能更优的成像工具。

该文章近日发表在国际顶尖学术期刊《Light: Science & Applications》，题为“Image scanning microscopy based on multifocal metalens for sub-diffraction-limited imaging of brain organoids ”， 韩国成均馆大学的Yongjae Jo是论文的第一作者，Inki Kim是论文的通信作者。

研究背景

亚波长尺度下的高分辨率成像，是解析生物微观结构功能、揭示疾病发病机制的核心技术支撑。近年来，ISM凭借像素重分配和去卷积技术，理论上可将光学分辨率提升一倍，且兼具光学切片能力，迅速成为生物成像领域的研究热点。然而，相较于传统宽场显微镜，实现高性能ISM的关键在于生成高密度、高均匀性的多焦点阵列，这一关键目标仍面临较大挑战。当前，数字微镜器件（DMDs）和微透镜阵列（MLAs）是生成多焦点阵列的常用方案，但DMDs成本高昂且对准复杂；MLAs受制造工艺限制，不仅数值孔径（NA）大小以及焦距范围会受到限制，更无法实现NA与焦距的独立调控。

超透镜凭借其纳米级结构能够实现卓越的光调制能力，但目前在ISM中的应用潜力尚未得到充分挖掘。现有的超透镜设计中，仍存在达曼光栅NA低、焦斑均匀性差等问题；相位叠加法虽能够整合多焦点相位，但易受相邻焦斑干涉影响，导致小间距阵列出现伪影；随机复用法能够解决干涉问题，但也会随焦斑数量增加导致光束质量下降，导致难以同时兼顾焦点密度与成像质量。

创新研究

多焦点超构透镜的设计：研究人员创新性地将相位叠加法与随机复用相结合，有效解决了相邻焦点相干干扰问题（图1）。研究人员首先将目标多焦点阵列拆分为交错排列的偶数/奇数焦点阵列，通过增大相邻焦点间距降低干涉（图1b）；再通过随机矩阵将两组相位图进行整合。最终制备出在488 nm波长下工作的氮化硅（SiN）多焦点超构透镜，并基于此构建了图像扫描显微镜（MMISM）（图1c）。

图1. MMISM系统及混合复用策略原理图。

多焦点超构透镜设计的优化：研究人员通过波传播模拟，采用焦斑数量40×40、焦斑间距3 μm、数值孔径0.7、工作波长488 nm的相同参数，证明混合复用方法生成的焦斑阵列信噪比（SNR）显著高于传统方法（图2c），焦斑均匀性（标准差STD、相对标准偏差RSD）降低30%以上（图2f-i），且焦斑半高全宽（FWHM）更接近衍射极限（图2e），表现出优于相位叠加法和随机复用的综合性能（图2b）。

图2. 多焦点超透镜的传统复用与混合复用方法表征及对比。

多焦点超构透镜的制造与表征：研究人员基于严格耦合波分析（RCWA）模拟分析不同尺寸元胞的相位调制特性，确定最优元胞结构参数。随后采用电子束光刻（EBL）技术成功制备出多焦点超构透镜样品（图3a-c）。对焦斑阵列的实验表征显示，实际测量的焦斑位置与仿真结果偏差小于0.1 μm（图3d、e），平均峰值强度达仿真值的86%（图3h），仅在距中心20-30 μm区域存在轻微强度衰减（图3i），焦斑半高全宽（FWHM）接近理论衍射极限（图 3f、g、j）。

图3. 多焦点超构透镜制备与性能表征。

基于多焦点超构透镜的ISM：最后，研究人员搭建了定制化荧光MMISM系统：首先通过多焦点超构透镜生成40×40焦斑阵列，对样品扫描并采集289帧（17×17）图像堆栈；再经数字针孔滤波去除离焦信号，通过像素重分配提升图像分辨率，最后经反卷积处理完成成像（图 4a）。并且，对0.03 μm荧光微珠的成像测试显示：MMISM系统水平方向分辨率达327 nm，垂直方向分辨率达373 nm，较宽场显微镜提升近一倍（图 4b-d）。在40 μm厚的人诱导多能干细胞（iPSC）来源脑类器官切片成像中，MMISM能清晰呈现神经元纤维的分支结构（图 4e-g），成功分辨出间距330-400 nm的亚衍射精细特征，而宽场成像因散射干扰无法区分这些结构（图4h）。

图4. MMISM成像性能验证。

总结与展望

研究人员提出混合复用策略设计多焦点超构透镜，结合相位叠加与随机复用优势，生成高密度均匀多焦点阵列，突破传统光学元件在数值孔径、焦距局限。并基于此构建MMISM系统，在对微珠和40 μm厚前脑类器官成像中，实现了330-370 nm的亚衍射极限分辨率（为宽场显微镜的两倍），且通过数字针孔技术有效抑制散射，清晰呈现神经元精细结构，为厚组织超分辨率成像提供了新方案。

未来，可通过规模化制造扩大超构透镜尺寸，提升MMISM的视场与成像速度；整合消色差设计实现多光谱成像，拓展生物医学应用场景。此外，结合多光子技术有望进一步提升深层组织穿透能力，推动 3D 神经元形态重建。该策略还可推广至多功能超构透镜设计，助力光学系统的微型化与集成化，为超分辨率显微镜的临床转化与多领域应用奠定基础。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-01900-3