论文标题：Optimization of a High-Throughput Human Papillomavirus Neutralizing Antibody Assay Based on Pseudotyped Viruses for the 15-Valent Human Papillomavirus Vaccine Types

论文链接：https://www.mdpi.com/1999-4915/17/9/1164

期刊名：Viruses

期刊主页：https://www.mdpi.com/journal/viruses

文章背景

宫颈癌是全球女性中第四大常见的恶性肿瘤。高危型人乳头瘤病毒持续感染被确认为宫颈癌发生的主要致病因素。目前已上市的二价、四价和九价预防性HPV疫苗在预防相应型别感染及相关疾病方面成效显著。为进一步扩大保护范围，多种多价候选疫苗（如十一价、十四价和十五价）正处于研发与临床阶段。其中，十五价疫苗是当前全球进入临床研究的价次最高的HPV疫苗。

中和抗体检测被世界卫生组织（WHO）推荐为评估疫苗保护性免疫反应的“金标准”。然而，传统的假病毒中和试验存在通量低、步骤繁琐、成本较高等局限性，难以满足多价疫苗研发中对大量样本的高效检测需求。为此，我们优化并验证了一种基于384孔板的高通量假病毒中和抗体检测方法，以支持多价HPV疫苗的免疫效果评价。

内容概要

本研究利用HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型共15个型别的假病毒与各型单价疫苗的兔抗血清的交叉中和结果（图1），筛选出交叉中和作用小且无相互干扰的型别。确定了五种用于联合检测的假病毒组合，HPV6-33-45、HPV31-11-58、HPV16-18-68、HPV39-51-35、HPV59-56-52，每组分别按顺序标记为绿色、红色和深红色荧光蛋白。通过比较多型联合检测假病毒组合与单型假病毒检测同一血清样本的结果，发现无明显差异，证明该假病毒组合可应用于联合检测。

图1. 15个型别假病毒与15个型别单阳性血清交叉中和反应抗体滴度热图

为了初步建立高通量检测方法，研究人员引入自动化检测仪器和384孔微孔板。针对不同参数的靶细胞加入量、病毒-血清孵育时间和检测时间，测定了十五价疫苗接种后血清样本的中和抗体滴度值。比较结果后，最终选择每孔3X10³个293FT的细胞加入量，无需病毒-血清预孵育，以及培养时间（60 h-96 h）作为最佳参数（图2）。根据上述参数，初步建立了高通量检测方法（图3）。

图2. 高通量检测方法的最佳试验参数选择

图3. 高通量检测方法的试验流程

为确保检测方法的可靠性，本研究对方法的特异性、血清截断值、线性范围、重复性、靶细胞使用代次以及Z因子等关键参数进行了系统验证。结果显示，该高通量方法具有良好的特异性、线性、重复性及耐用性；通过高通量筛选实验对稳健性与适用性参数的验证（Z因子为0.66），进一步表明本方法可作为评估HPV疫苗免疫原性的可靠高通量中和试验手段。尤为重要的是，研究基于16–26岁女性阴性血清确定了方法的血清阴阳性截断值，为其在临床试验及疫苗研发中的应用提供了便利。相较于传统假病毒中和试验，本方法将单日样本检测量提升约6.7倍，成像速度提高约4倍，反应体系体积缩小约5倍，显著提升了检测通量与效率。

研究总结

本研究面向高价次HPV疫苗（涵盖HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型别）的免疫原性评价需求，建立了一种高通量中和抗体检测方法。该方法采用表达绿色、红色与深红色荧光蛋白的多型别HPV假病毒组合，结合自动化操作平台与384孔微孔板技术，实现了检测通量的大幅提升，为HPV多价疫苗的免疫效果评估和流行病学研究提供了高效、可靠的技术支持。

原文出自 Viruses 期刊

Liu, H.; Qin, H.; Nie, L.; Shen, Y.; Li, J.; Xiu, P.; Wang, S.; Wang, M.; Wang, Y.; Nie, J.; et al. Optimization of a High-Throughput Human Papillomavirus Neutralizing Antibody Assay Based on Pseudotyped Viruses for the 15-Valent Human Papillomavirus Vaccine Types. Viruses 2025, 17, 1164.