2024年7月9日，南京大学生命科学学院的研究团队在Nature Synthesis期刊上发表了一篇题为“Insight into the role of a trans-AT polyketide synthase in the biosynthesis of lankacidin-type natural products”的研究论文。该研究通过体内、体外重构阐明了trans-AT聚酮合成酶在lankacidin类天然产物生物合成中的特殊迭代作用。此外，还对trans-AT PKS中的跨模块作用的MT结构域、冗余的KS-ACP结构域等进行了功能表征。

南京大学生命科学学院博士后麦振鹏为论文第一作者，南京大学生命科学学院张博副教授、谭仁祥教授和戈惠明教授为该工作的通讯作者。此外，南京大学化学化工学院姚祝军教授对该工作给予了大力支持和指导。

Trans-AT聚酮合成酶可以合成大量结构特殊、活性多样的聚酮分子。这些酶中同时存在多种特殊模块或结构域，如β-分支模块、分支结构域和BV氧化结构域等，可在装配线上直接对延伸的聚酮骨架进行修饰并增加产物的结构多样性。然而，在trans-AT PKS的非经典催化过程中，单一模块或功能域的迭代使用过程尤为特殊。前期，科学家们发现在lankacindin类天然产物的生物合成过程中，仅含有四个trans-AT聚酮合酶却负责八轮聚酮骨架的延伸，因此学术界长久以来认为该trans-AT PKS进行了特殊的迭代作用，并提出两种不同推测过程（图1）。

图1：chejuenolin的推测生物合成过程。

近日，南京大学生命科学学院的研究团队通过体内、体外重构阐明了trans-AT聚酮合成酶在lankacidin类天然产物生物合成中的特殊迭代作用。此外，还对trans-AT PKS中的跨模块作用的MT结构域、冗余的KS-ACP结构域等进行了功能表征。最终研究团队，以经典I型聚酮的“模块化思维”对trans-AT聚酮合酶进行拆分和重构，并体外对新产生的“模块化trans-AT PKS”进行功能验证。最终研究团队成功将全部trans-AT聚酮合酶进行融合，产生出～763 KDa的重组酶并在大肠杆菌中实现了相应天然产物的生产，为trans-AT PKS的特殊迭代作用过程提供直接实验证据，并首次提出了衔接上下结构域的特殊迭代作用过程。

CheC蛋白迭代功能验证

首先，研究团队过表达并纯化了chejuenolin生物合成所需的所有蛋白，并体外重构了chejuenolin的生物合成过程。为了验证两种推测的生物合成路径的正确性，研究团队化学合成了所有潜在聚酮中间体的硫酯衍生物，并将trans-AT聚酮合酶CheC蛋白拆分为三个“亚蛋白”，分别通过碱水解和蛋白质谱两种方式，对潜在延伸的聚酮分子进行质谱检测（图2）。当以合成的相应分子为对照，并2b-5b分别作为底物，两种方法都成功地检测到了相应的聚酮延伸中间体，首次证明了CheC的特殊迭代作用。

图2：CheC蛋白迭代功能验证。

途径中其他跨模块和冗余结构域的功能验证

Chejuenolide结构中存在着四个由MT结构域引入的甲基单元，但所有trans-PKS中仅存在一个MT功能域。在路径i的生物合成过程中，C10和C16位的甲基化由CheC蛋白负责，但是C2和C4位的甲基化是否仍由CheC中的MeT功能域跨模块进行尚不清楚。研究团队通过将MT功能域单独表达并纯化后，通过体外实验证明，该MT结构域的加入能够产生出甲基化中间体8a，而不添加该MT结构域，则会检测到去甲基中间体8c。因此证明CheC中的MT同时跨模块甲基化作用。此外，研究团队通过点突变蛋白的体外酶反应，证明模块9中存在的任意一组KS-ACP都能满足chejuenolide的生物合成。

图3：LC-MS分析工程化的trans-AT PKS。

Trans-AT PKS的工程化改造

研究团队以模块化的思维对trans-AT PKS进行了工程化改造，产生了CheM1、CheM2、CheM3、CheM7-9共6个模块化蛋白，并通过体外酶促实验对所有蛋白质功能进行验证，发现所有改造的模块化蛋白都具有相应功能，且CheM3同样具有多次延伸功能（图3a）。

在明确了各个模块化trans-AT PKS能够发挥功能后，研究团队进一步对所有trans-AT PKS进行了蛋白质融合。经过多轮融合与分析后，成功将CheA+C+F+G融合，最终形成了～763 KDa巨型融合蛋白，并在大肠杆菌中成功表征其功能（图3b）。至此，提出单一的CheC的特殊催化过程，其既能与上游蛋白形成CheM2，与下游蛋白形成CheM7进行常规线性延伸，此外，其自身能以环形结构形成CheM3，发挥迭代作用，实现聚酮骨架的多轮延伸（图4）。

图4：CheC的特殊作用方式。

综上，研究团队通过体内外实验，成功重构了完整的chejuenolide的生物合成途径，并为CheC的迭代作用提供了直接的实验证据。大量系统性分析工作，验证了CheC的特殊作用方式和过程，进一步揭示了trans-AT PKS独特的化学和酶学特征，为人工PKS蛋白的合理设计提供了有价值的见解。

该研究得到了国家重点研发计划、国家自然基金及中央高校基本科研业务费等项目的资助。（来源：科学网）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s44160-024-00599-1