作者:Philip Tinnefeld 来源:《光:科学与应用》 发布时间:2023/5/26 12:57:44
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新型3D超分辨纳米显微镜

 

近日,来自德国慕尼黑大学化学系和纳米科学中心的Philip Tinnefeld教授团队提出通过将pMINFLUX的2D定位与石墨烯能量转移(GET)的轴向信息以及DNA-PAINT的单分子切换相结合来实现3D超分辨率纳米显微镜。并以“Combining pMINFLUX, Graphene Energy Transfer and DNA-PAINT for Nanometer Precise 3D Super-Resolution Microscopy”为题发表在国际顶尖学术期刊《Light: Science & Applications》。

研究背景

3D超分辨技术可以实现分子甚至亚分子级别的分辨率,为纳米结构和生物系统提供了全新的视角。目前,已有多种技术将单分子定位显微镜(SMLM)扩展到三维,包括PSF操作、4-Pi显微镜、全内反射荧光显微镜(TIRF)、重复光学选择性曝光(ROSE-Z)或超临界角定位显微镜(SALM)等。然而,在这些技术中,相机定位无法达到三维1-2nm的荧光分子精度。3D受激发射损耗(STED)显微镜的坐标定位方法存在类似的精度限制。为此,研究者们引入了MINFLUX纳米显微镜和后来的MINSTED纳米显微镜。通过使用一系列针对性的照明来查询发射源位置,可以在中等光子下达到小于2nm的精度,通过叠加涡旋光束来生成“拓扑帽”,将其扩展到三维。然而,随着维度的增加,仪器和工程也需要随之增加,光子被分配在轴向和横向维度之间。每个光子只针对横向或轴向定位做出响应。

除了光学方法外,荧光染料的轴向位置可以通过与盖玻片的近场相互作用来确定。为此,从荧光强度或荧光寿命读出染料与金属或石墨烯层之间的能量转移,并将其转换为轴向信息,称为金属诱导能量转移(MIET)或石墨烯能量转移(GET)方法。在玻璃基上的石墨烯盖玻片的GET具有高光学基底透明度(>97%)、无自发荧光和d-4量级的距离依赖性等优点,可以在其动态范围内实现最高的定位精度。

创新研究

3D纳米级超分辨率显微镜是补充荧光成像与超结构技术的关键。Philip Tinnefeld教授团队通过将pMINFLUX的二维定位与石墨烯能量转移(GET)的轴向信息和DNA-PAINT的单分子切换相结合,实现了三维超分辨率。pMINFLUX和GET代表了一种特殊的协同组合,适用于近表面的超分辨率成像,例如细胞粘附和膜复合物,因为每个光子的信息都用于二维和轴向定位信息。此外,研究者引入了局部PAINT(L-PAINT),其中DNA-PAINT成像链上配备了一个用于局部浓缩成像的额外序列。pMINFLUX,GET和DNA-PAINT的组合代表了一种特别有效和多功能的方法,可以实现纳米级精度的三维超分辨率成像,使其能够直接观察和分析复杂的结构和生物系统,并达到前所未有的详细水平,此外还具有L-PAINT对成像局部聚集的能力。

图1 将pMINFLUX与石墨烯能量转移(GET)相结合,实现精确的3D定位。(a)上图:DNA结构示意图,其中单个染料位于石墨烯上方16nm的高度。下图:单个DNA折纸结构中单个染料分子总荧光强度的轨迹。(b)四个脉冲交错涡旋形光束中的每一个荧光衰减信号,这些光束聚焦在以三角形图案排列的样品上。星形表示染料分子的xy位置。(c)xy定位直方图。(d)荧光寿命分布。(e)从(d)的荧光寿命计算石墨烯z的距离分布。(f)使用pMINFLUX的2D信息和与荧光寿命的z距离对全荧光强度轨迹进行3D定位。单独的定位以黑色显示,在侧面显示了相应的投影,x、y为1nm,z为0.2nm。

研究人员展示了所有三维的定位精度都小于2nm,轴向精度达到0.3nm以下。在3D DNA-PAINT测量中,结构特征(即在3nm距离处的单个对接链)直接解析在DNA折纸结构上。这些技术对于很多领域都具有重要意义,从基础生物学和生物物理学到材料科学和纳米技术,很可能会在未来几年开创许多科学发现和技术创新的机会。

图2 p-MINFLUX和GET组合的性能。(a)用N=2000的固定光子数分析具有12至30nm范围内不同染料位置的示例性分子与石墨烯的距离z的分布。(b)用于评估精度的单个固定染料在与石墨烯z相距16nm处的示例性3D定位图,其具有不同数量的光子N。(c)x、y和z的定位精度是放置在不同高度的固定染料分子的光子数N的函数。灰色条纹表示MINFLUX在相应实验中的x、y精度,线条表示精度的理论下限。

图3 用pMINFLUX和GET进行超分辨率DNA-PAINT成像。(a)具有突出对接部位的成像结构示意图。(b)DNA-PAINT轨迹的3D定位,侧面有相应的投影。沿x轴和y轴的分格为1.5nm,沿z轴的分格为0.5nm。(c)所选x、y定位到石墨烯z的距离直方图。(d)相对于平均分子位置的x、y定位直方图。

图4 使用pMINFLUX和GET进行L-PAINT成像。(a L-PAINT成像器线束示意图。(b) 一种DNA结构,具有3条突出的链。(c)石墨烯上的DNA结构缩小图。(d)荧光强度迹线,2秒处有一条红线。(e)2秒后L-PANT迹线的3D定位。(f)30秒L-PANT轨迹的3D定位,侧面有相应的投影。(g)xz投影的2D直方图,分格为1nm,定位时间分格从15到50ms不等。(h)到x轴每个平均结合位置的距离直方图。(i)到y轴每个平均结合位置的距离直方图。(j)到石墨烯z的距离直方图。

该研究成果以“Combining pMINFLUX, Graphene Energy Transfer and DNA-PAINT for Nanometer Precise 3D Super-Resolution Microscopy”为题发表在《Light: Science & Applications》。Jonas Zähringer为本文的第一作者,Philip Tinnefeld为本文的通讯作者。(来源:LightScienceApplications微信公众号)

想论文信息:‍https://www.nature.com/articles/s41377‍-023-0‍1111-8

 
 
 
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