论文标题：Increasing Cas9-mediated homology-directed repair ef?ciency through covalent tethering of DNA repair template

期刊：Communications Biology

作者：Wendy R. Gordon et al

发表时间：2018/05/31

数字识别码：10.1038/s42003-018-0054-2

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-018-0054-2?utm_source=Other_website&utm_medium=Website_links&utm_content=RenLi-Nature-Communications_Biology-Biochemical_Research_Methods-China&utm_campaign=NEWCOMMS_USG_JRCN_RL_sciencenet_Cas9_Aug_2nd

近日在《通讯-生物学》发表的一项名为Increasing Cas9-mediated homology-directed repair ef?ciency through covalent tethering of DNA repair template的研究，描述了美国明尼苏达大学基因工程中心的Wendy Gordon 的团队发现的能够增加Cas9介导的同源定向DNA 修复的效率的研究。

CRISPR/Cas9是有力的基因组编辑工具。研究者们已经成功地找出用CRISPR/Cas9系统把基因关闭、启动或者修复的方法。但是因为CRISPR/Cas9系统的准确率不稳定，所以专家们在把其应用在众多疾病，比如X染色体断裂症候群，镰状细胞贫血，亨廷顿疾病的临床治疗上一直持保守态度。研究者们也发现，不同的引导DNA，不同的靶基因，基因组里不同的区域，不同的细胞系，或者取自不同器官、组织、或者病人的细胞里，CRISPR/Cas9系统的成功率也大有不同。虽然有些环境会让CRISPR/Cas9的成功率高达近100%，但是多数的环境会导致很低甚至近于零的成功率。所以研究者们已经着手研究增加CRISPR/Cas9的成功率的策略，比如改变Cas9蛋白质的结构，加入其他的DNA 片段来干扰细胞原有的DNA修复功能等等。但是这些策略仍然会受细胞种类或者靶基因在基因组里的位置的影响。

在现有的系统里，虽然Cas9 蛋白质和引导DNA通常是被包装在一起送入靶细胞，但是它们之间没有共价键。以前已经有研究团队显示，把引导DNA和一个与Cas9相似的被改进的蛋白质用共价键结合，会增加其同源定向DNA的修复的效率。但是那个方法的工序过于复杂和昂贵。

于是Wendy Gordon的团队想寻找另外一个把引导DNA用共价键和Cas9结合，以增加CRISPR/Cas9的系统的效率的策略。他们之前发现，HUH内切酶和单链DNA之间能够容易并快速地形成磷酸酪氨酸键。于是他们设计和制造了一个HUH内切酶和Cas9的融合蛋白，然后证明这个融合蛋白能够和单链DNA形成共价键。他们的研究显示，这个融合蛋白和也是单链的引导DNA的复合体能够把同源定向修复的成功率增加30倍。他们的初步数据显示，这个策略不会受到细胞种类或靶基因在基因组里的位置的影响。而且这个方法比之前的方法更简洁和低成本。

Wendy Gordon的团队希望以这个策略为增加CRISPR/Cas9系统的效率做出贡献。

摘要：The CRISPR-Cas9 system is a powerful genome-editing tool in which a guide RNA targets Cas9 to a site in the genome, where the Cas9 nuclease then induces a double-stranded break (DSB). The potential of CRISPR-Cas9 to deliver precise genome editing is hindered by the low efficiency of homology-directed repair (HDR), which is required to incorporate a donor DNA template encoding desired genome edits near the DSB. We present a strategy to enhance HDR efficiency by covalently tethering a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) to the Cas9-guide RNA ribonucleoprotein (RNP) complex via a fused HUH endonuclease, thus spatially and temporally co-localizing the DSB machinery and donor DNA. We demonstrate up to a 30-fold enhancement of HDR using several editing assays, including repair of a frameshift and in-frame insertions of protein tags. The improved HDR efficiency is observed in multiple cell types and target loci and is more pronounced at low RNP concentrations.

阅读论文全文请访问：https://www.nature.com/articles/s42003-018-0054-2?utm_source=Other_website&utm_medium=Website_links&utm_content=RenLi-Nature-Communications_Biology-Biochemical_Research_Methods-China&utm_campaign=NEWCOMMS_USG_JRCN_RL_sciencenet_Cas9_Aug_2nd

期刊介绍：Communications Biology is an open access journal from Nature Research publishing high-quality research, reviews and commentary in all areas of the biological sciences. Research papers published by the journal represent significant advances bringing new biological insight to a specialized area of research.

（来源：科学网）