来源:International Journal of Molecular Sciences 发布时间:2021/5/7 19:56:49
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大肠癌潜在分子标记物——新型环状RNA | MDPI IJMS

论文标题:Identification of Two Novel Circular RNAs Deriving from BCL2L12 and Investigation of Their Potential Value as a Molecular Signature in Colorectal Cancer(鉴定两个源自BCL2L12的新型环状RNA及其在大肠癌中作为分子签名的潜在价值的研究)

期刊:IJMS

作者:Paraskevi Karousi, Pinelopi I. Artemaki, Christina D. Sotiropoulou, Spyridon Christodoulou, Andreas Scorilas and Christos K. Kontos

发表时间:23 November 2020

DOI:10.3390/ijms21228867

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期刊链接:

https://www.mdpi.com/journal/ijms

大肠癌是在结肠或直肠中发生的恶性肿瘤,在每年诊断出的所有癌症和与癌症相关的死亡中,大肠癌约占10%,也因此它成为了女性中诊断出的第二大常见癌症,男性中诊断出的第三大常见癌症[1]。由于大肠癌的高死亡率,学界进行了许多尝试来阐明其分子背景,并发现了三种被认为在直肠癌的发展中起着基本作用的特定基因类别:肿瘤抑制基因 (如APC、DCC、TP53和SMAD蛋白家族)、癌基因 (如KRAS和NRAS) 和DNA修复基因[2]。研究表明,作为BCL2家族的成员,BCL2L12 mRNA在大肠癌中含量丰富,可被表征为大肠癌患者预后良好的分子指标,而源自BCL2L12的环状RNA (circRNA) 作为分子生物标志物的效用也已经出现,但其中只有少数几个在大肠癌 (CRC) 中得到了研究。

图片来源:Pixabay

近期,来自雅典大学的Christos K. Kontos教授及其研究团队在IJMS (International Journal of Molecular Sciences) 上发表的文章中,对一种针对大肠癌诊断的生物标记物进行了研究,分析鉴定了两种源自BCL2L12的新型circRNA,并且评估了它们在大肠癌中作为分子生物标记物的作用。

实验步骤

新型circRNA的鉴定

作者鉴定了两个新的来自BCL2L12的circRNA。这两者都只包含外显子,第一个被称为circ-BCL2L12-1,包括截短的第6和1号外显子,第2、3和4个外显子以及扩展的第5外显子。两种circRNA的外显子结构和序列如图1所示。

BCL2L12环状RNA (circRNA) 的结构和序列。(a,b) 圆圈外面的箭头表示在第一轮PCR分析中使用的引物的退火位置。(c,d) 圆圈内的箭头指示在半巢式PCR分析中使用的引物的退火位置,而圆弧指示各自的扩增子。(e,f) BCL2L12 circRNA的序列,从反向剪接位点开始。外显子序列的彩色字体与circRNA外显子结构的图解说明中使用的颜色匹配。黑框显示了预测的开放阅读框 (ORF) 的推定翻译起始密码子和终止密码子。ORF为灰色虚线下划线部分。

定量实时qPCR分析标准化

实时定量PCR分析已标准化,可用于特定的BCL2L12 circRNA定量。为了确保每种测定的定量结果,作者使用聚合酶链反应 (PCR) 产物的系列稀释液,为每个扩增子生成标准曲线。对于circ-BCL2L12-1和circ-BCL2L12-2标准曲线,作者将来自Caco-2细胞系cDNA预扩增的PCR产物进行系列稀释,而对于HPRT1标准曲线,则是将来自新鲜冷冻组织标本的cDNA进行了预扩增和连续稀释。HPRT1、circ-BCL2L12-1和circ-BCL2L12-2标准曲线的效率分别为91%、96%和107%,这一结果可满足定量结果的先决条件。每个熔解曲线是独特的,表明扩增子的特异性。

通过绘制阈值循环 (CT) 相对于稀释液绘制的标准曲线,以及观察到的熔解曲线。对于标准曲线,使用由Caco-2 cDNA预扩增产生的PCR产物。(a) circ-BCL2L12-1的标准曲线;使用Caco-2 PCR产物的8倍系列稀释液。(b) circ-BCL2L12-2的标准曲线;使用了Caco-2 PCR产物的4倍系列稀释液。(c) circ-BCL2L12-1的融解曲线;(d) circ-BCL2L12-2的熔解曲线。

分析BCL2L12 circRNA表达

通过以上实验,作者BCL2L12 circRNA在CRC细胞系中的表达进行了分析。基于预扩增和qPCR分析,作者相对定量了两种circRNA在Caco-2、HCT 116、HT-29、COLO 205、SW 620、DLD-1和RKO CRC细胞系中的表达水平。circ-BCL2L12-1存在于所有CRC细胞系中,而在其中两个,即Caco-2和HCT 116中检测到circ-BCL2L12-2。这两个细胞系中circ-BCL2L12-1的表达水平较高比circ-BCL2L12-2大。两种circRNA的qPCR分析的扩增图如图3所示。

circ-BCL2L12-1 (a) 和circ-BCL2L12-2 (b) 在结直肠癌 (CRC) 细胞系中的扩增图。

实验结果

Circ-BCL2L12-1作为CRC预后不良的潜在分子指标

Kaplan–Meier生存分析揭示了circ-BCL2L12-1对整体生存 (OS) 的预后潜力。具体而言,与circ-BCL2L12-1水平较高的CRC患者相比,circ-BCL2L12-1水平较低的CRC患者的OS间隔明显缩短 (p = 0.036;图4a)。此外,在TNM II期患者的亚组中显示了与OS有关的类似结果 (p = 0.045;图4b)。

图4. CRC患者的Kaplan-Meier总生存 (OS) 曲线。(a) 所有根据circ-BCL2L12-1表达分类的CRC患者;与circ-BCL2L12-1-低水平患者相比,circ-BCL2L12-1-高水平患者的OS明显较差。(b) TNM II期患者,根据circ-BCL2L12-1表达分类;与circ-BCL2L12-1-低水平患者相比,circ-BCL2L12-1-高水平患者的OS明显较差 (p值表示该比较)。

本研究揭示了BCL2L12衍生的circRNA的存在。据生物统计学分析表明,circ-BCL2L12-1可以用作CRC患者OS不良预后的分子生物学标记,并且可以根据其OS间隔为目标患者提供更好的分层。circ-BCL2L12-2被预测为具有一个功能性ORF,但未预测到IRES。评估这些新型circRNA与患者其他分子特征 (例如RAS或BRAF或TP53突变以及MMR缺乏症) 的推定关联将给予学界更多启发。本研究的局限性在于这些新型circRNA作为分子生物标志物的动态还未得到充分阐明。

参考文献

1. Dekker, E.; Tanis, P.J.; Vleugels, J.L.A.; Kasi, P.M.; Wallace, M.B. Colorectal cancer. Lancet 2019, 394, 1467–1480, doi:10.1016/S0140-6736(19)32319-0.

2. Artemaki, P.I.; Scorilas, A.; Kontos, C.K. Circular RNAs: A New Piece in the Colorectal Cancer Puzzle. Cancers 2020, 12, 2464, doi:10.3390/cancers12092464.

期刊简介

International Journal of Molecular Sciences (IJMS)(ISSN 1422-0067;IF 4.556) 是国际同行评审的开放获取期刊,包含主题为生物化学、分子和细胞生物学、分子生物物理学、分子医学以及化学分子研究等方面。IJMS采取单盲同行评审,一审周期约为10天,文章从接收到发表仅需2天。

 
 
 
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