作者:倪伟波 唐琳 来源:中国科学报 发布时间:2020/9/24 14:32:08
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海森“慧眼”识佩梅

 

陈良怡教授(右)和郑晓璐博士(左)在活细胞成像实验室利用SD-SIM显微镜观察少突胶质细胞并讨论PLP1蛋白定位情况。

 王静敏教授(左一)带领团队成员在查阅患儿的头颅核磁,并仔细地为大家讲解头颅核磁中出现的病灶及相关影像学知识。

 

上世纪90年代末,中国山东。

烈日炎炎的夏日,空气炽热得令人窒息。然而安姨一家并未受到丝毫影响,他们正全身心期待着新生命的降临。

大宝的到来,让安姨夫妇感受到了前所未有的开心与满足。然而,随着孩子慢慢长大,夫妻俩发现大宝的身体有些异样——三四个月大的大宝不能抬头,眼球出现震颤,甚至到了1岁还坐不稳,也不能爬、不能独站或独走、不能自己拿水杯喝水。

夫妻俩带着大宝几乎跑遍了县里、市里和省城的各大医院,但医生们也一筹莫展,只是怀疑可能是难产引起的。

时隔十年,夫妻俩迎来了二宝。为了避免生产时出现意外,这次他们选择了剖宫产。然而,担心的事情再次发生。出生20多天时,躺在床上的二宝忽然出现眼球左右震颤,一家人悬着的心瞬间崩溃,发育障碍的剧情又一次在这个不幸的家庭中上演。

随后的8年里,安姨夫妇带着孩子四处求医问诊,导致入不敷出、债务缠身。功夫不负有心人,辗转多地后,孩子们的病症终于得到确诊:两个孩子患有罕见的佩梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease,PMD),目前尚无有效的治疗方案。

对安姨一家而言,这无疑是另一场漫长等待的开始。

近日,一项在线发表在《科学通报》上的最新研究或许能帮助安姨一家燃起新的希望。

北京大学陈良怡团队联合北京大学第一医院儿科王静敏团队,利用活细胞超分辨率成像对佩梅病展开研究,首次建立了该疾病不同分型在细胞水平上的表征,揭示了其不同的发病机制,并利用该平台成功筛选出可特异性恢复最严重佩梅病疾病表型的对症药物。

罕见的“常见病”

1885年,德国医生Pelizaeus首次报道了5例男性佩梅病患儿的家系,佩梅病开始引起医学界和学术界的广泛关注。

佩梅病是目前已知19种中枢神经系统髓鞘化缺陷导致的以脑白质发育不良为主要表现的髓鞘化低下性脑白质营养不良疾病(HLD)谱系中最具代表性的疾病,也被称作“HLD1型”。

该病症为X染色体隐性遗传疾病,全球发病率为十万到几十万分之一,临床特征表现为眼球震颤、智力运动发育落后、痉挛性截瘫、共济失调等。

随着医疗技术的不断提升,越来越多的佩梅病患者得到确诊。但在北京大学第一医院儿科教授王静敏看来,佩梅病属于罕见病中的“常见病”。近十年来,北京大学第一医院小儿神经科已确诊佩梅病病例超过百例。

已有研究表明,佩梅病主要由于X染色体上的PLP1基因重复或错义突变致病,PLP1蛋白是中枢神经系统髓鞘蛋白的主要成分,其突变会引起神经髓鞘合成障碍以及正常髓鞘形成缺陷,进而导致该病的发生。

作为严重的致死、致残性神经遗传病,佩梅病依据临床症状从重到轻分为先天型、中间型和经典型三类。但对于为何同一PLP1基因异常导致出现不同严重程度的佩梅病分型,国际科学界始终一筹莫展。

“看清”佩梅病

想要研究佩梅病的致病机制及有效治疗药物,自然离不开病理学“利器”。

2018年,北京大学分子医学研究所陈良怡团队自主研发的超灵敏海森结构光超分辨率显微镜(Hessian-SIM),兼具了硬件创新与算法创新,大幅度拓展了其在活细胞上的应用,目前已成为细胞生物学研究的重要工具。

在当年召开的北京神经科学年会上,陈良怡就“海森”的研究成果进行了主题报告。彼时,台下的王静敏听得入神,仿佛在黑暗中看到了久违的光明。

“陈老师所搭建的平台是国际上该领域的顶级平台之一,而我们团队在过去的15年中积累了包括佩梅病在内的髓鞘形成低下性脑白质营养不良的大量病例。基于中国人口基数较大,这些病例是国际上单中心最大样本量的佩梅病研究中心。鉴于此,我们达成了一致的合作意向。”《科学通报》所报道工作的通讯作者之一王静敏在接受《中国科学报》采访时表示。

正是这次邂逅,让两支团队擦出了“火花”,也有了意外的收获。

研究团队在佩梅病患者群中选取了7种病人来源的不同临床分型的PLP1错义突变,利用海森结构光超分辨成像手段,观察比较正常和疾病细胞内PLP1蛋白运输与分泌过程的差异。

研究发现,PLP1的突变会引起三种细胞表型,与病人的临床分型完美对应。不仅如此,超分辨率成像还揭示了亚型间不同的发病机制:最严重表型细胞中PLP1驻留在内质网中,引起内质网的形变;中间型细胞中很大一部分PLP1转运出内质网和高尔基体,但是被错误分选到溶酶体中;轻微表型的细胞中PLP1被正确地分选到转运囊泡中,但是这些囊泡在转运、锚定到细胞质膜下以及与细胞膜融合的过程存在缺陷。

“研究结果显示,当将超分辨率显微成像用于细胞水平的病理研究,我们不仅可以在细胞水平上找到佩梅病不同分型之间的标志物,还可以揭示之前临床上未知的不同分型之间不同发病机制,并进一步基于细胞超分辨率成像系统,找到能够恢复最严重表型细胞的临床药物。”此项工作的通讯作者之一陈良怡向《中国科学报》表示。

备受期待的治疗药物

既然PLP1错义突变在细胞水平上的表型与病人整体临床表型密切相关,那么尝试在细胞水平上筛选能够缓解细胞表型的药物自然就被提上了日程。

基于研究结果,研究团队筛选出两种在细胞水平上可以缓解最严重细胞表型的化合物,分别为胆固醇(Cholesterol)和姜黄素(Curcumin)。

“我们发现胆固醇可以改善最严重的几种错义突变的细胞表型,反而对中等和轻微的错义突变表型没有影响。”文章第一作者、北京大学分子医学研究所博士郑晓璐对《中国科学报》解释道。

这个结果表明,与之前认为PLP1蛋白与胆固醇只在高尔基体发生相互作用不同,内质网上PLP1与胆固醇相互作用,参与了PLP1的出内质网过程。这也暗示了该疾病可能的药物干扰靶点。

研究团队筛选出的另一种药物——姜黄素,同样可以显著改善PLP1突变的严重细胞表型,使得严重表型向中间型转换。

值得注意的是,与2020年7月1日美国凯斯西储大学Paul J. Tesar研究组在《自然》杂志上发表的、通过基于可控基因操纵的方法抑制蛋白脂蛋白PLP1可以达到在小鼠上缓解佩梅病症状的工作相比,此项工作筛选出来的姜黄素可以跨越血脑屏障,并且已被用于其他疾病的临床治疗,具有可靠的安全性,因此可以更快以“老药新用”的形式进入临床试验。

“本研究获得的两种药物可能改善细胞病理表现,无疑对佩梅病的治疗指明了方向,让患者也拥有了希望。目前我们团队正在对注册的佩梅病患者进行大型随访研究,期望很快获得他们的临床基本数据,为下一步开展临床试验打下坚实的基础。”王静敏充满信心地表示。

在陈良怡看来,这个平台还可以以姜黄素类型的药物为起点,筛选优化出对佩梅病更有效力的化合物或药物,这将为长期遭受这一疾病折磨的患者及家庭带来希望。

形成良性闭环研究

任何科学创新的取得,从来都不是一蹴而就的。两年来,陈良怡、王静敏带领研究团队坚持不懈地开展了一系列富有成效的研究工作,攻克了一道又一道难关,为如今的突破奠定了基础。

初次“牵手”时,首先摆在两支团队面前的一大难题便是临床研究与基础研究的磨合。

“临床团队是我们科学问题的源头,也是我们所期待发现药物的出口,是否能够缓解临床病人的疾病是我们最关心的问题。基础研究的团队主要在于把新技术、新方法用在这个问题研究上,并发现、阐明佩梅病的不同分型是囊泡转运受阻在不同阶段的经典细胞生物学问题。因此,两支团队需要跨越学科的边界,需要一定时间的磨合,才能实现有效的合作。”陈良怡坦言。

疾病是一个动态、完整的过程,需要科研人员与临床医生进行互动,从而逐步逼近疾病的本质规律。作为两支团队的领军人,陈良怡和王静敏对此了然于胸。他们运筹帷幄,与团队成员齐心协力,快速有效地对研究思路和研究方法进行实时调整,研究也取得了很大的进展。

刚接手这个课题时,由于对这种少突胶质细胞的培养和转染规律缺乏经验,郑晓璐没少走过“弯路”。

“细胞虽然看起来不错,但是转染内质网标记物和PLP1蛋白的效率极低。此外由于一些严重突变类型的PLP1有细胞致死性,导致细胞即使成功表达了外源蛋白,但是被标记的细胞已死亡,不能进行活细胞成像。”郑晓璐说。

随后,经过一段时间的测试,她将转染试剂更换为Lipofectamin 3000,同时有效控制试剂用量、质粒用量、测试蛋白表达时间等,终于摸索出了相对稳定的MO3.13活细胞转染成像流程。

研究结果的取得固然令人振奋,然而如何应用这些结果来解释临床现象,却成为王静敏心中的另一个困惑。

为此,两支团队不断地讨论、实验、交叉合作,最终通过对表型进行整理分析,阐明了实验室研究结果与表型明确的相关关系,更好地解释了临床现象,完成了以临床研究为起点进行基础研究、基础研究后再回归指导临床研究的良性闭环通路。

目前,进一步的研究仍在紧锣密鼓地进行中。“之前我们根据髓鞘形成相关的研究,确定了7种可能有作用的药物,目前只筛选了两种。我们计划进一步测试另外5种,并测试它们之间的相互关系,以及是否联合用药会有更多改善。”陈良怡表示。

王静敏补充道,在未来的研究中,他们将会以佩梅病临床实验室相结合的研究模式作为示范,深入探讨目前已经命名的19种HLD共同的病理特征——髓鞘形成低下,从而揭示其共同机制,各个击破,为这类疾病的治疗提供实验依据。

陈良怡很喜欢美国诗人狄金森的《如果我能使一颗心免于哀伤》,而这首诗歌也真实地吐露出团队成员此刻的心声。

如果我能使一颗心免于哀伤

我就不虚此生

如果我能解除一个生命的痛苦

平息一种酸辛

帮助一只昏厥的知更鸟

重新回到巢中

我就不虚此生

相关论文信息:http://dx.doi.org/ 10.1016/j.scib.2020.08.016

 
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