作者:张章 来源:中国科学报 发布时间:2017/4/12 9:18:28
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RNA修饰成学界热点
技术难关仍待突破

 

我们并不清楚一个分子上有多少不同的修饰。但有一点很清楚,这个领域非常有意思,值得继续深究下去。

 

这是一个与mRNA结合的细菌核糖体的分子模式图。

图片来源:Laguna Design

今天,表观转录组学研究正在蓬勃开展,不过相关的技术仍不够完善,还需要继续开发。例如,目前技术的灵敏性尚有不足,无法对少量稀有样本开展研究,无法对转录组修饰开展定量研究,并且无法通过一次试验发现多种不同的修饰等。而技术上的问题早在多年前就一直困扰着研究人员。

2004年,以色列特拉维夫大学肿瘤学家 Gideon Rechavi和同事将当时能找到的所有人类基因组DNA 序列与对应的信使RNA(mRNA)进行了比对,希望找到mRNA序列里的腺嘌呤转换成次黄嘌呤的信号。

这种转换会改变蛋白质的编码序列,对人类而言,这是保证天然免疫系统正常功能的关键因素。Rechavi回忆道:“这项工作听起来简单,但实际上非常复杂。多个研究小组都曾尝试过,但都以失败告终。”主要因为当时的测序技术还不发达,会产生很多错误的测序结果,进而带来很大数据噪声。

但Rechavi等人使用了新的生物信息学工具,所以成功地在转录组中发现了数千个转换位点—— 一个有机体或细胞群中的所有mRNA,后续的研究又陆续将这些转换位点的数量增加到了数百万个。

不过,次黄嘌呤转换算得上是一种特例:科研人员只需将DNA序列与RNA序列进行比对就能发现这些位点。但在mRNA序列里,至少有1/4 的核酸(A、C、G、U)是携带化学修饰物的(表观遗传学修饰),而现有的测序方法无法发现这些修饰物,科研人员也不知道这些修饰物会给RNA带来何种改变。

近年来,学界掀起了一股研究RNA表观遗传学修饰的热潮,很多课题组都将目光集中在 N6—甲基腺苷(m6A)这个核酸分子上,研究在全转录组水平上的这种化学修饰,以及该修饰与人体健康和疾病的关系。但该研究面临的问题非常大,因为这种修饰不仅发生在mRNA分子上,也发生在其他RNA 分子上,几乎涉及生命科学的所有领域,连病毒的RNA都会发生这种修饰。

其实这些修饰本身并不新奇。人们之所以如此关注这种修饰,是因为发现了与这些修饰有关的酶,并且对其有了一定的认识和理解。2010 年,美国芝加哥大学化学家何川提出,这种化学修饰反应是可逆的,而且对于基因表达调控具有非常重要的作用和意义。

不久之后,何川课题组发现了mRNA化学修饰去除酶——FTO。该发现意味着m6A不只是一个被动的修饰物,细胞也可以逆转这种修饰反应,即mRNA的化学修饰是可以由细胞来操控的。

用抗体绘图

早在上世纪70年代初,科学家就发现mRNA存在化学修饰现象,当时使用的技术是对m6A进行放射性标记。但因为这些实验都是通过mRNA 3’端多聚腺嘌呤尾高选择性技术富集mRNA分子,所以科研人员担心这会掺杂进其他种类的RNA。

美国威尔·康奈尔医学院化学生物学家 Samie Jaffrey表示,“正是因为这个原因,让他们无法确定mRNA里是否还存在其他RNA以及是否发生了‘污染’,人们最终放弃了这种方案。”

另一个难题是确定mRNA里哪些位点发生了m6A修饰。传统测序技术会用到逆转录反应,即将RNA逆转录成互补DNA(cDNA),然后再对cDNA 进行扩增及测序。可是这些逆转录酶会去除mRNA上的修饰物。对此,Jaffrey 指出,所以人们根本看不到m6A。

不过虽然存在这些技术上的障碍,科学家还是在细菌的RNA上发现了一些修饰现象,这也引起了Jaffrey 的兴趣,她决定看看在哺乳动物的RNA里是否也存在这种修饰。

她和同事、遗传学家Chris Mason一起,首先将RNA分子切成小片段,然后用含有特异性针对m6A的抗体对这些片段进行洗脱,最后对富集后含有m6A修饰物的RNA分子测序。通过这种方法,她们清楚地看到了mRNA上的修饰物,而且完全没有污染。Rechavi课题组也通过类似方法发现了大量的m6A修饰位点。目前,这些名为m6A-seq和MeRIP-seq的研究方法已经被人们广泛采用。

多种修饰

其他RNA 化学修饰也引起了科研人员的注意。2016 年,由中国北京大学化学家伊成器、Rechavi与何川共同领导的两个课题小组使用新抗体技术,实现了全转录组水平上N1—甲基腺苷(m1A)这一可逆RNA修饰的谱图鉴定,发现m1A修饰能够促进蛋白质的翻译过程。

虽然研究人员尚不清楚m1A的具体作用,但已经找到了一条线索,即绝大多数RNA都只含有一个m1A位点,而且这些被修饰过的位点的翻译频率要远远高于其他未修饰的位点。Rechavi说:“这让我们非常兴奋,当然也是一个挑战,因为我们即将面对的是一套全新的mRNA翻译调控机制。”

而其他全转录组化学修饰研究策略,主要利用的就是某些RNA修饰物能够与化学标签结合的特性。当伊成器在2011年末建立自己的实验室时,人们已经非常清楚,在其他RNA里含有很多修饰过的RNA组成的核酸——假尿嘧啶,但在mRNA里还没有发现过这些核苷。

2015 年,伊成器实验室发现了一种化学标记和洗脱方法,可用于富集mRNA上的化学修饰物。出乎预料的是,他们在人和小鼠的mRNA中发现了大量假尿嘧啶。于是他们开始专注于研究这些化学修饰物的功能。

伊成器认为,“mRNA里的假尿嘧啶可能具有多重功能,这取决于它们在什么时候、什么位置、如何出现,以及是如何对RNA进行调控的。”目前人们也发现了很多假尿嘧啶写入因子,但还不清楚是否存在假尿嘧啶擦除因子和识别因子。

不论是抗体还是化学标记,发现RNA中化学修饰位置都是一项非常麻烦的工作。例如,使用抗体时会面临交叉反应的问题,因此,科研人员必须使用两种以上的抗体进行实验,而且还得进行交叉验证。而使用化学标记方法又有可能更倾向于切断、结合和富集某些特定的RNA片段并带来偏倚。

伊成器表示,测序深度和所使用的生物信息学软件会影响人们发现RNA修饰位点的工作。此外,细胞培养时间也会影响RNA的修饰水平。

优化工具

但无论何时,仅知道某个化学修饰是远远不够的。芝加哥大学分子生物学家Tao Pan 指出,人们还需要对所有的RNA修饰进行定量分析,因为细胞也许就是依靠一定量的RNA修饰才能进行某种功能。对于那些希望通过激活RNA修饰相关蛋白调控修饰水平的科研人员而言,这种修饰定量信息尤为重要。

2015 年,Pan课题组提出了RNA修饰定量研究策略,至少可用于转录RNA(tRNA)的修饰研究。该策略采用了一种特殊的逆转录酶,能以较高的效率通读待测RNA分子,哪怕分子中有很多位点已经发生了化学修饰,也不影响该逆转录酶的效率。

但最快速了解这些化学修饰物功能的方法可能就是发现它们的识别因子、写入因子和擦除因子。一旦人们发现了能够识别某种化学修饰物的因子,那么就可以很容易地通过基因编辑技术调控该因子的表达,从而帮助科学家在全局上发现化学修饰改变的迹象。

近几年,何川课题组又发现RNA修饰是一种转录子调控机制,参与了细胞内多种不同的作用。因此,科学家迫切需要更多、更好的新技术来探索这些奥秘。

去年10 月,美国国立卫生研究院给何川和Pan提供了一个为期5年、总金额为1060万美元的资助,以帮助他们建立一个新中心,用于开发与RNA修饰研究有关的新技术。

借助新影像学技术,人们有可能在肉眼下看到某个RNA分子上的修饰物。此外,科学家开发出新的RNA直接测序技术,以替代传统测序方法。比如英国牛津纳米孔技术公司成功将DNA纳米孔测序技术拓展成RNA纳米孔测序技术。

但目前仍存在其他挑战,例如在数据方面就有不小的困难,比如RNA修饰的绝对数量就是个问题。在一个RNA分子上找出所有的修饰,这需要对软件进行大量严格的训练,才能够让它们准确地识别并区分每一个修饰位点的具体情况。约翰斯·霍普金斯大学生物医学工程师Winston Timp 说:“我们并不清楚一个分子上有多少不同的修饰。但有一点很清楚,这个领域非常有意思,值得继续深究下去。”(张章编译)

《中国科学报》 (2017-04-12 第3版 国际)
 
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