作者:王盈颖 来源:澎湃新闻 发布时间:2016/7/31 15:04:13
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多国科学家称韩春雨成果无法重复,要求公开数据

 

 
韩春雨
 
河北科技大学副教授韩春雨震惊全球学术界的新基因编辑技术NgAgo-gDNA,正遭遇越来越多的质疑。从5月2日他的论文发布在《自然-生物技术》网络版之后,到现在为止,全球仍没有一家实验室对外宣布,能够完全成功重复韩春雨的实验。现在已有多国科学家要求《自然-生物技术》介入调查,并公开韩春雨实验中的所有原始数据和实验条件。
 
北京时间7月29日,一度支持韩春雨的澳大利亚国立大学的基因学家Gaetan Burgio,反戈一击。他在Twitter上发布长文《我的NgAgo经历》,否认了自己7月15日之前部分重复实验时得出的结论,表示并无严格意义上的证据显示韩春雨的NgAgo-gDNA技术有基因编辑的迹象,并且要求韩春雨公开所有原始数据和实验条件。
 
7月31日下午,澎湃新闻(www.thepaper.cn)联系韩春雨寻求回应,韩春雨表示“似乎不用我回应,我看了下,跟帖留言的人不少内行”。
 
韩春雨的NgAgo-gDNA技术,挑战的是最为流行的基因编辑技术CRISPR-CAS9,论文刚一发表,就引发了轰动。基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。目前CRISPR-CAS9是最为普遍的基因编辑技术,被称为“基因魔剪”。 5月2日,韩春雨课题组的论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《Nature Biotechnology》在线发表。绕开时兴的CRISPR-CAS9技术,课题组利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute核酸内切酶,以DNA为介导进行基因组编辑,简称NgAgo-gDNA。
 
质疑韩春雨的Gaetan Burgio在7月29日发布的长文中介绍了重复实验的具体过程操作和结论,附带了7张实验结果图。
 
 
受精卵原核注射NgAgo之后,基于囊胚的PCR结果。
 
对NgAgo注射过的受精卵PCR产物的T7核酸内切酶检测。
 
 
当用高浓度5磷酸化的ssDNA(25纳克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和电泳凝胶。
 
 
对小鼠囊胚进行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后获得囊胚,进行DNA提取、PCR扩增和测序之后的一个典型测序结果。
 
微注射NgAgo的小鼠受精卵凝胶电泳。
 
代表性的所有电泳胶的序列的Clustal比对。Ank-1作为参考序列。
 
一个代表性测序色谱图(使用反向引物测序)。
 
 
他表示:在多番尝试、试验3个不同的细胞后,没有发现严格意义上证明NgAgo发生基因编辑的证据;在他看来,NgAgo酶需要加热到50摄氏度才能有效,对37摄氏度下NgAgo内切酶的活性表示质疑。
 
在长文中,Gaetan Burgio表示,“《自然生物技术》期刊应该要求韩春雨公开所有的原始数据和实验条件”,并认为:“NgAgo的未来并不明朗。”
 
Gaetan Burgio选择了小鼠受精卵进行重复实验。因为他长期研究小鼠细胞,较为熟悉,并在两年半前,用小鼠细胞,完成了他的首次CRISPR-Cas9基因编辑。由于韩春雨的论文中使用的是人体细胞,严格意义上来说,Gaetan Burgio和韩春雨所做的不是同一个实验。但由于小鼠和人体结构相似,一般认为人体细胞能完成的实验也能在小鼠细胞上进行。
 
在Gaetan Burgio发文后不久,来自西班牙高等科学委员会(CSIC)下设的国立生物技术中心(Centro Nacional de Biotecnologia)的科学家Lluis Montoliu转发了该文,并在Twitter上写道:“CRISPR万岁!!!CRISPR-Cas9系统会用上数百亿万年而不衰。难以击垮。”
 
 
 
据公开资料显示,2015年,Lluis Montoliu从非营利组织“国际转基因技术协会”(The International Society for Transgenic Technologies)卸任主席之位。他的Twitter简介显示,Lluis Montoliu的研究方向是哺乳动物的基因组,以及基于转基因动物研究人类的罕见疾病。
 
Lluis Montoliu在Twitter上透露,在NgAgo之前,他们曾用大约2年时间,试图测试Ago家族中来自Thermus thermophiles嗜热栖热菌的酶TtAgo,但同样失败。
 
随后,7月30日,Lluis Montoliu更新博文称,他已经停止了所有关于NgAgo的项目,同时“建议所有想做这件事人不要再浪费资源”。
 
7月30日傍晚,方舟子在Twitter上贴出四张邮件截图,并附文称“国际转基因技术协会原主席Montoliu今天向协会会员发信,建议停止验证河北科大韩春雨实验,不要再浪费时间、金钱和人员。针对该技术调查表明,140个回复中,只有一个(中国神经所仇子龙?)回答有效,73 个无效,63 个在验证。” 
 
图片显示,发件方为代表Lluis Montoliu的“国际转基因技术协会”,邮件名为“对Ago的巨大失望:CRISPR万岁!”,发送时间为当地时间7月29日上午9点49分。邮件用加粗字体写道:“(目前最重要的信息是)NgAgo在哺乳动物细胞的基因编辑中不起作用”、“我建议所有人放弃涉及NgAgo的项目”。
 
方舟子所贴的邮件截图。
 
 
但Lluis Montoliu及其所处的“国际转基因技术协会”的言论,引发了部分国内科学家的不满,其中包括中国科学院上海神经科学研究所研究员仇子龙。7月30日晚上,他在实名认证的微博上质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。
 
 
仇子龙发文质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。
 
此前,仇子龙被传出重复实验成功。7月20日,科学网有博文称仇子龙成功重复韩春雨的实验。但仇子龙本人在7月21日作出回应,表示实验室仍在重复,优化各种条件,目前的实验结果距离韩春雨论文中的结果“相差甚远”,并呼吁韩春雨提供“可重复NBT发表文章的NgAgo,或者优化的Ngago2.0,smart版本等等”。
 
对NgAgo的质疑声自6月下旬开始就陆陆续续,韩春雨本人在百度贴吧上做出过一些回应。
 
6月28日,他在对网友的回复中表示,新系统刚出来都会“不好使”,他也认同目前NgAgo系统不够稳定,等2.0版本出来会找专门机构免费发放。
 
面对质疑,他说,“我敢把质粒提交到addgen上,在协和讲座发放质粒,对自己实验的重复性还是很有胆气的。”韩春雨所说的“addgen”其实是Addgene,一家全球科学家质粒共享的非盈利组织。澎湃新闻(www.thepaper.cn)在Addgene官网上的确看到了韩春雨上传的质粒信息。这些质粒可供全球科学家直接用于重复韩春雨的实验。
 
7月2日,在贴有方舟子质疑原文的帖子中,韩春雨进行了较为详细的回应,强调NgAgo系统对污染特别敏感,实验时不要有寄生菌和支原体的污染,并对实验环节做出技术性的建议。
 
但7月2日之后,韩春雨不再有新的回复。7月4日,澎湃新闻(www.thepaper.cn)联系上韩春雨,他以“学校告诉我不要做任何回应”回绝。
 
有基因学家对澎湃新闻(www.thepaper.cn)表示,如果最终《自然-生物技术》杂志在介入调查后也认为韩春雨的实验是无效的,那么他在5月2日发表的论文将会被《自然-生物技术》删除。
 

 

 
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