导读

近日，来自深圳大学与国防科技大学的刘晓利教授和于起峰院士联合研究团队在国际顶级学术期刊《Light: Science & Applications》发表最新研究成果，提出了一种基于计算成像的荧光显微点扩散函数（PSF）解耦方法。计算荧光显微成像系统通过照明和成像链路的多自由度调控实现了多样化PSF工程改造和成像性能突破，其中，特异性系统响应的精确表征是一个挑战性难题。为此，团队提出了一种以样本先验驱动的PSF计算解耦框架，在无需理论建模和亚衍射极限颗粒测量的条件下，实现了计算显微系统响应的非参数化表征。该方法利用常规荧光样本作为系统调制介质，通过宽场样本先验引导从系统调制信号中优化解耦出表征系统特异性的精确PSF，提升计算荧光显微成像性能。通过孔径调制计算荧光显微实验验证了该方法在多种生物组织成像中能够实现多色、大景深、高分辨、高保真三维成像。该方法为计算显微成像系统的通用表征与性能重构开辟了新路径，在生物医学与材料学等领域展现出广阔应用前景。相关成果以 “Point spread function decoupling in computational fluorescence microscopy” 为题发表于《Light: Science & Applications》。

研究背景

荧光显微成像以分子特异性标记揭示细胞与组织的精细结构和动力学特征，极大拓宽了生命活动的微观观测边界。随着计算成像理论和技术的迅速发展，其与荧光显微结合，在光学层面引入可控调制、在算法层面实现精确解调，构建了光学与计算深度融合的计算荧光显微成像体系，突破了传统显微成像在分辨率、视场及景深等方面的性能限制。计算显微成像系统的点扩散函数（PSF）是调制系统特性的核心表征，决定了成像系统的特异信号筛选能力与计算重建准确性。由于计算显微成像系统的调控自由度高且多样化，目前的系统表征方法面临通用性和精确性不足等难题。传统PSF理论建模依赖于理想化的成像条件和系统参数，精确系统表征较为复杂且可能偏离实际成像。使用亚衍射极限颗粒估计系统PSF虽具直观性，但在调制系统下存在信噪比低和成像深度受限等问题。因此，通过PSF理论计算和实验测量的直接获取方法难以适用于具有高自由度与动态可调特性的计算显微成像，促使研究者提出计算系统表征思想，通过计算荧光显微成像的调制与解调机制，从观测信号中反演系统PSF，实现系统响应的非参数化表征，从而为计算显微成像的极限性能探索提供坚实的方法基础。

研究亮点

为此，团队提出了一种基于样本先验的计算PSF解耦方法，使用常规荧光样本作为系统调制介质，构建了宽场与计算显微成像之间的先验通道，实现了计算荧光显微成像的非参数化系统表征。引入基于最大似然估计与先验约束的迭代优化策略，在样本先验引导下，从系统调制信号中获取系统响应，实现PSF解耦。如图1所示，整个流程通过宽场与调制图像堆栈的协同反演获得计算PSF，并将其应用于反卷积重建，实现高对比度、高分辨率荧光体成像。

图1：计算荧光显微PSF解耦原理。(a) 计算荧光显微系统示意图，系统响应可通过等效孔径调制进行优化；(b) PSF解耦流程，使用常规荧光样本作为系统调制器，并以宽场反卷积结果作为样本先验，优化计算系统PSF。

该PSF解耦方法具有三方面优势：（1）相比于盲反卷积对PSF与体数据进行交替计算，在宽场样本先验的强支撑下能够更稳定、更精确地解耦PSF；（2）适用于不同光学调制方式，避免理论建模的复杂性与系统误差，实现非参数化系统表征；（3）突破亚衍射极限颗粒测量的信噪比与深度限制，使得计算PSF具备样本特异性，能够高保真复原样本结构和特性。通过随机振幅孔径调制的仿真验证表明，盲反卷积所得PSF偏离真值，而PSF解耦能够准确恢复系统响应并获得一致的体成像效果（图2b–2c）。

图2：复杂光学调制的PSF解耦仿真实验。(a) 开源样本作为真值；(b) 理论PSF（tPSF）、盲反卷积PSF（bPSF）与计算PSF（cPSF）的边缘x-y切片及其三维强度分布、中心x-z切片；(c) 原始图像堆栈的最大强度投影及采用不同PSF的反卷积结果对比。比例尺：50 μm (a)，20 μm (c)。

图3：计算荧光显微成像的性能对比。向日葵茎样本的(a) cPSF反卷积结果的x-y切片，(b) – (c)不同区域的局部放大视图，(d) c中黄色与粉色箭头标识区域的截面强度分布曲线，分别对比了原始图，BD、mPSF和cPSF反卷积结果。比例尺：50 μm (a)，20 μm (b, c)。

图3展示了厚度9 µm的向日葵茎维管束的反卷积结果。相比盲反卷积与测量PSF，计算PSF显著增强了暗部颗粒的成像对比度，清晰解析出微晶与导管双层结构，展现了更高的结构分辨率与保真度。视频1展示了厚度20 µm的马铃薯块茎样本的图像堆栈最大强度投影图，对比了原始图像和盲反卷积、测量PSF，计算PSF的反卷积结果。利用本方法准确的PSF解耦和反卷积可复原识别出在原始图像中已经完全淹没于背景信号的淀粉颗粒。

总结与展望

本研究提出了一种基于样本先验的计算荧光显微PSF解耦方法，利用常规荧光样本作为系统调制介质，在计算成像层面实现了非参数化系统表征，突破了传统理论建模与亚衍射极限颗粒测量在精确性与通用性等方面的限制。在多类生物组织与细胞成像实验中，该方法以孔径调制计算荧光显微成像为例，展现出与共聚焦显微成像相当的光学切片性能与分辨率提升能力，并在多通道与大景深成像条件下实现了高对比度、高保真度体成像。这种以样本先验驱动的计算系统表征策略，为复杂光学系统的自适应建模与高维成像提供了全新的思路与方法，有望进一步拓展至多模态与超分辨显微成像领域，满足生命科学研究中对高时空分辨与高保真成像的迫切需求。从更宏观的视角看，本研究揭示了计算成像在显微学范式中的深度嵌入与价值重构，进一步发掘了计算荧光显微成像的潜能，推动显微成像由传统“光学显微”迈向融合物理与算法的“计算显微”新时代。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-02112-5